利多卡因、烏司他丁預(yù)處理腦保護作用的實驗研究

錢耀亮 劉鳳芹 肖 龍

圍手術(shù)期的腦保護一直以來備受麻醉醫(yī)師的高度關(guān)注，手術(shù)過程中易出現(xiàn)腦缺血再灌注損傷，圍手術(shù)期腦保護的預(yù)處理對患者的預(yù)后起到了至關(guān)重要的作用。國內(nèi)外學(xué)者深入探討了單獨使用利多卡因或者烏司他丁對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響，本研究對二者聯(lián)合預(yù)處理做進一步的研究，以探討利多卡因及烏司他丁聯(lián)合預(yù)處理的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠120只，體重200～250 g，動物由廣東省實驗動物中心提供。隨機分為4組：對照組(C組)，利多卡因預(yù)處理組(L組)，烏司他丁預(yù)處理組(U組)，利多卡因與烏司他丁聯(lián)合預(yù)處理組(L+U組)，全部大鼠行腦缺血再灌注。

1.2 動物模型的建立

大鼠飼養(yǎng)及手術(shù)室溫控制于25℃左右，術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠給予腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉后，取仰臥位固定，備皮，碘伏消毒，取頸區(qū)正中切口，鈍性分離頸部肌肉，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈近心端，于頸內(nèi)動脈遠心端備線，在頸總動脈分叉處剪一約0.2 mm“V”形切口，用直徑約0.24 mm的尼龍線(頭端粘附過多聚賴氨酸，后用肝素浸泡處理，呈錐形，頭端直徑約0.26～0.28 mm)，經(jīng)切口插入頸內(nèi)動脈約(18±1)mm，遇有輕微阻力，表明栓線穿過大腦中動脈起始端至近端，將大腦中動脈起始端阻塞結(jié)扎頸內(nèi)動脈，扎緊備線并固定栓線，栓線外端留出約8 mm長，縫合皮膚。缺血2 h后，只需將栓線抽至頸內(nèi)動脈起始部(拔出約10 mm)，即可恢復(fù)大腦中動脈血供，實現(xiàn)再灌注。L組于術(shù)前30 min予利多卡因10 mg/kg腹腔內(nèi)注射，U組于術(shù)前30 min予烏司他丁20萬U/kg腹腔內(nèi)注射，L+U組于術(shù)前30 min予利多卡因10 mg/kg，烏司他丁20萬U/kg腹腔內(nèi)注射，C組于術(shù)前30 min予生理鹽水2 mL腹腔內(nèi)注射。

1.3 神經(jīng)功能評分

再灌注后72 h從各組隨機選取存活之10只大鼠，觀察大鼠行為障礙的程度。采取雙盲法進行評分，參考Longa等的5分制法將行為障礙進行分級評分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動正常者為0分；不能完全伸展對側(cè)前爪者為1分；行走時出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈者為2分；行走時身體向?qū)?cè)倒者為3分；不能自行行走，意識喪失者為4分。1～3分為建模成功。

1.4 腦梗死體積比率測定

再灌注72 h后，各組隨機取4只大鼠用10%水合氯醛50 mg/kg麻醉后迅速斷頭取腦(除去小腦及腦干)，腦組織取出后置于-20℃低溫冰箱快速(約5 min)冷凍后，由前向后取冠狀面每隔2 mm切取組織片5～6片，置于2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃水浴中避光孵育20～30 min，每5 min翻動一次，待顯色完全后置甲醛溶液固定一周。線粒體過氧化氫酶可氧化TTC，使存活組織呈深紅色，壞死組織不著色呈蒼白色。用數(shù)碼相機將每片固定好腦組織片照相后，稱重，并肉眼下小心挖取梗死腦組織再稱重，計算出梗死區(qū)域重量及腦梗死體積比率(腦梗死體積比率=梗死區(qū)域重量/全腦重量)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析進行統(tǒng)計，同組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組缺血后神經(jīng)功能評分無顯著差異。再灌注72 h后，C組神經(jīng)功能評分較缺血后顯著升高，并顯著高于3個預(yù)處理組，其余各組缺血后與再灌注72 h神經(jīng)功能評分無顯著差異，3個預(yù)處理組之間神經(jīng)功能評分無顯著差異。腦梗死區(qū)域體積及腦梗死體積比率方面，C組顯著高于其他組，L組與U組之間無顯著差異，L+U組分別低于L組和U組，見表1。

組別缺血后神經(jīng)功能評分/分再灌注后神經(jīng)功能評分/分腦梗死體積比率/%C組2.13±0.242.99±0.551)38.56±5.36L組2.17±0.522.2±0.392)27.34±3.272)U組2.08±0.352.05±0.42)26.88±4.112)L+U組2.11±0.411.98±0.362)20.83±3.022)3)

注：C組與缺血后比較，1)P<0.05；與C組比較，2)P<0.05；分別與L組和U組比較，3)P<0.05

3 討論

在全世界范圍內(nèi)，腦缺血發(fā)作是致殘的最常見原因。腦缺血時，由于缺氧導(dǎo)致細胞的能量代謝障礙和酸中毒，大腦局部的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，恢復(fù)血液供應(yīng)后，腦功能不僅未能恢復(fù)，反而出現(xiàn)了進行性加重的損傷，這一現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷(Cerebral Ischemia-reperfusion Injury, CIRI)。本研究中C組大鼠再灌注72 h后神經(jīng)功能評分顯著高于缺血后，表現(xiàn)為典型的CIRI。CIRI是一個十分復(fù)雜的病理生理過程，主要機制包括：氧自由基過度生成，細胞內(nèi)鈣超載，興奮性氨基酸的毒性作用，線粒體損傷，炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等[1-4]。

腦缺血是心臟或神經(jīng)外科手術(shù)的常見并發(fā)癥，預(yù)防性使用神經(jīng)保護藥物可能對手術(shù)患者由缺血導(dǎo)致的腦損傷有益。利多卡因是一種局麻藥和抗心律失常藥，可通過血腦屏障，具有減少缺血區(qū)的跨膜離子轉(zhuǎn)運，減少興奮性毒素的釋放，減慢新陳代謝，抑制炎癥反應(yīng)及維持腦部血流供應(yīng)等特點，從而可以在圍手術(shù)期提供腦保護作用[5]。韓樹海等[6]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)利多卡因能顯著促進腦缺血再灌注大鼠腦組織中熱休克蛋白(HSP70)的表達，顯著改善缺血后神經(jīng)功能缺陷，減輕腦組織形態(tài)學(xué)損傷。提示利多卡因的腦保護作用與促進腦缺血再灌注時HSP70的表達有關(guān)。Lei B等[7]的研究表明利多卡因可減少半暗區(qū)細胞色素C的釋放，抑制半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶3的激活，減少DNA的斷裂，在早期促進電生理學(xué)的恢復(fù)并縮小皮層梗死范圍。提示利多卡因可能通過抑制半暗區(qū)細胞凋亡來達到上述腦保護作用。施賢清等[8]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)利多卡因預(yù)處理可使超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性升高，而使內(nèi)皮素(ET)的含量降低，提示利多卡因的腦保護作用與其增加體內(nèi)抗氧化物質(zhì)SOD、GSH的活性及拮抗ET的毒性有關(guān)。此外，利多卡因預(yù)處理還可抑制水通道蛋白4的表達，而后者可誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致神經(jīng)細胞的損傷[9]。本研究中利多卡因預(yù)處理組再灌注后神經(jīng)功能評分及腦梗死體積比率均顯著低于對照組，表明利多卡因預(yù)處理可有效減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷，與文獻報道相一致。

烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，另具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子產(chǎn)生，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用[10]。動物實驗已經(jīng)證明，烏司他丁可通過降低缺血區(qū)中性粒細胞的浸潤，減小梗死體積來改善缺血再灌注損傷后的腦功能[11]。鄧玉萍等[12]的研究顯示烏司他丁可使腦缺血再灌注后的大鼠神經(jīng)功能缺損明顯改善，腦梗死體積減小，細胞凋亡數(shù)減少。其機制可能是烏司他丁增加缺血區(qū)GRP78蛋白表達，抑制CHOP和Caspase-12蛋白表達，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制細胞凋亡。本研究中烏司他丁預(yù)處理組的大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評分及腦梗死體積比率均顯著低于對照組，顯示出與利多卡因預(yù)處理組相類似的腦保護作用。

利多卡因與烏司他丁腦保護的作用機理不同，二者聯(lián)合應(yīng)用的腦保護作用少見文獻報道。本研究中L+U組雖然在再灌注后神經(jīng)功能評分方面與L組和U組無顯著差異，但腦梗死體積比率顯著小于上兩組，顯示出更強的腦保護作用，為臨床預(yù)防腦缺血再灌注損傷提供了新的用藥思路。今后在二者聯(lián)合應(yīng)用提供腦保護的作用機制和用藥安全方面尚需做進一步的深入探討。

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