碳酸鈉堿性介質(zhì)氧脫木素促進火炬松酶解糖化的研究

張雨情 吳淑芳，* Hasan Jameel Houmin Chang

(1. 南京林業(yè)大學(xué)江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，江蘇南京，210037；2.北卡州立大學(xué)林業(yè)生物材料系，美國羅利，27695)

木質(zhì)纖維原料是地球上儲量最豐富的可再生資源。利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)生物質(zhì)乙醇的研究受到了廣泛關(guān)注[1- 5]。制備生物質(zhì)乙醇首先需將木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵單糖，再將單糖進一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇。其中纖維素酶水解法是將木質(zhì)纖維原料中的聚糖轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵單糖的最有效方法之一，為了提高酶解效率，酶解前須對木質(zhì)纖維原料進行預(yù)處理，以增加酶對纖維素底物的可及度，同時適當除去木質(zhì)素等影響纖維素酶對底物作用的障礙。酶解效率的高低直接影響生物質(zhì)乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟可行性，而預(yù)處理效果直接影響酶解效率，因此預(yù)處理技術(shù)直接和間接影響著生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟性，是生產(chǎn)生物質(zhì)乙醇非常重要的一個環(huán)節(jié)。過去幾十年，人們對木質(zhì)纖維原料預(yù)處理以及酶解技術(shù)進行了大量的研究，并且取得了較大的進展[6]。盡管如此，目前仍然存在酶解底物轉(zhuǎn)化不完全、原料中聚糖至可發(fā)酵單糖提取率低等問題。

木質(zhì)纖維原料特別是針葉材，由于復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，造成了其天然的抗生物降解特性，因此，酶解前有效的預(yù)處理對于提高酶解效率尤為重要。目前對于針葉材的預(yù)處理研究主要有酸水解[7]、濕氧化[8]、蒸汽爆破[9]、SO2處理[10]、氧脫木素[11- 12]、催化處理[13]、有機溶劑處理[14]、氨水浸泡[15]、亞硫酸鹽處理[16]、堿處理[17]和超臨界二氧化碳預(yù)處理[18]等方法。這些預(yù)處理方法均能夠不同程度提高酶解效率，但與闊葉材和其他木質(zhì)纖維原料相比，其單糖提取率仍然偏低，導(dǎo)致總的生產(chǎn)成本偏高而難于實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。有些處理方法甚至還產(chǎn)生廢液，增加處理消耗，使整個工藝過程變得復(fù)雜。堿法預(yù)處理如硫酸鹽預(yù)處理和綠液預(yù)處理是可操作性較強的針葉材預(yù)處理方法[19]，不僅能有效脫出部分木素，且蒸煮廢液堿回收工藝成熟，綠液蒸煮甚至還可使堿回收工藝簡化[11，19]。適當程度的堿法蒸煮結(jié)合氧脫木素處理可有效提高酶解效率[17]，尤其是，采用適宜的氧脫木素工藝可使碳水化合物損失較少，提高單糖提取率。本研究是在傳統(tǒng)的氧脫木素方法的基礎(chǔ)上，采用碳酸鈉作為氧脫木素的堿性介質(zhì)，通過延長氧脫木素時間，優(yōu)化氧脫木素工藝，以期達到更高的木素脫出率和更好的脫木素選擇性，從而通過后續(xù)酶解提高原料中聚糖至可發(fā)酵單糖的轉(zhuǎn)化率。

1 實 驗

1.1 原料和試劑

火炬松木片由美國南方某工廠提供。首先對木片進行篩選，選取尺寸為9.5～15.9 mm的木片用于本實驗，實驗所有化學(xué)藥品均為分析純試劑。

1.2 蒸煮

蒸煮在7 L 的M/K 蒸煮器內(nèi)進行(M/K Systems Inc.， Danvers， MA)。硫酸鹽法(KP)蒸煮最高溫度170℃，用堿量14%(以Na2O計)，硫化度25%，液比1∶4，H因子600；綠液法(GL)蒸煮最高溫度160℃，用堿量20%(以Na2O計)，硫化度40%，液比1∶4，H因子800。蒸煮后的漿料用自來水充分洗滌后盤磨(縫隙0.13 mm)解離、0.2 mm縫隙篩漿機篩選，所得篩渣再磨后與之前篩出的漿料合并、離心脫水后備用。KP蒸煮得率61.9%，木素含量18.6%。GL蒸煮得率75%，木素含量30.6%。

1.3 氧脫木素

氧脫木素在2.8 L空氣浴回轉(zhuǎn)反應(yīng)器內(nèi)完成。氧脫木素后，冷水洗滌漿料，離心后樣品備用。

1.4 打漿

使用PFI磨打漿，絕干漿30 g，漿濃10%，打漿轉(zhuǎn)數(shù)90000轉(zhuǎn)。

1.5 酶解

采用諾維信公司的Cellic?CTec2和 HTec2產(chǎn)品，以1 FPU∶1.2 FXU比例對氧脫木素后的漿料進行酶解。FPU為濾紙酶活，按照Ghose 1987方法測定[20]，1 FPU酶活定義為每分鐘從Whatman No.1濾紙中釋放出1 μmol葡萄糖所需的酶液量；FXU為聚木糖酶活性，也是按照Ghose 1987方法測定[21]，1 FXU酶活定義為每分鐘從聚木糖中釋放出1 μmol木糖所需的酶液量。

酶解在三角瓶內(nèi)于空氣浴搖床中進行，漿濃5%，溫度50℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，酶解48 h。

1.6 分析方法

原料及預(yù)處理后樣品的木素和碳水化合物含量按照美國國家再生能源實驗室方法進行測定[22]。稀酸水解液中單糖含量采用離子色譜(ICS- 3000， Dionex， Sunnyvale， CA)，CarboPacTMPA1(2 × 250 mm)分析柱和 CarboPacTMPA1(4 × 50 mm)保護柱，洗脫液為0.1 mol/L NaOH溶液；酶解液中單糖含量采用高壓液相色譜(HPLC， Agilent Technology 1200 series， Palo Alto， CA)測定，Shodex SP0810分離柱，去離子水洗脫，流速0.6 mL/min，溫度80℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒸煮和氧脫木素對原料組分的影響

火炬松木片分別經(jīng)KP和GL蒸煮，再在Na2CO3堿性介質(zhì)中進行氧脫木素，所得漿料分別標記為KP-OC漿和GL-OC漿，并與NaOH氧脫木素漿(分別為KP-O漿和GL-O漿)進行比較，氧脫木素的條件及結(jié)果列于表1。相對于NaOH作為堿性介質(zhì)的氧脫木素，Na2CO3作為堿性介質(zhì)時氧脫木素溫度由110℃升高到120℃，時間也由1 h調(diào)整為4 h。Na2CO3用量也較高，相對于蒸煮后的漿料分別為10%和20%。由表1中反應(yīng)結(jié)果可見，KP蒸煮的漿料用Na2CO3作為堿性介質(zhì)氧脫木素所得得率與NaOH相比均相差不到2個百分點，但木素脫出率則有明顯差異，Na2CO3為堿性介質(zhì)的高溫、長時間處理的木素脫出率遠遠高于NaOH堿性介質(zhì)的短時間處理，并且前者脫木素選擇性也更好。當Na2CO3用量越高時，木素脫出率也越高，但脫木素選擇性卻隨之下降，盡管如此，其脫木素選擇性仍明顯高于以NaOH為堿性介質(zhì)的氧脫木素選擇性。GL蒸煮漿料在不同條件下的氧脫木素情況與KP漿相似，與KP漿不同的是，GL漿用Na2CO3氧脫木素時選擇性劣于以NaOH為堿性介質(zhì)的氧脫木素選擇性，且隨著Na2CO3用量提高，脫木素選擇性也提高。

表1 氧脫木素條件和結(jié)果

注 木素含量基于氧脫木素后樣品；木素脫出率=(氧脫木素前樣品木素含量-氧脫木素后樣品木素含量)/氧脫木素前樣品木素含量，計算中木素含量均需換算為基于氧脫木素前樣品；脫木素選擇性以氧脫木素前后木素含量差與得率減少量之比表示。O：表示NaOH(用量5%)堿性介質(zhì)的氧脫木素，OC- 10和OC- 20：表示Na2CO3(用量10%和20%)堿性介質(zhì)的氧脫木素，以下同。

火炬松木片經(jīng)KP和GL蒸煮后得到的樣品其木素含量相差較大，分別為18.6%和30.6%。不同木素含量的漿料，即使在相同的氧脫木素條件下，其木素脫出率也有較大差異。譬如，相同溫度和時間條件下，當Na2CO3用量分別為10%和20%時，KP漿木素脫出率分別可達71.5%和79.1%，而相同條件下GL漿只有45.0%和55.3%。這可能因為KP蒸煮時木素降解溶出較多，殘留的木素結(jié)構(gòu)單元中的部分化學(xué)鍵也已經(jīng)斷裂，因此，氧脫木素時更容易降解且溶出；而殘留在GL漿中的木素分子破壞程度相對較小，所以，氧脫木素過程中降解溶出相對比較困難。

表2 顯示的是木材原料及其蒸煮、氧脫木素后漿料的化學(xué)組成。表2中數(shù)據(jù)可見，木片經(jīng)KP和GL蒸煮后，木素含量由原料中的28.0%分別降至11.5%和23.0%，顯然，本研究的實驗條件下，KP蒸煮脫木素能力更強，相應(yīng)的，其碳水化合物的損失也稍高，由原料中的63.8%降至49.1%，損失14.7個百分點。而GL蒸煮后聚糖含量降至52.5%，損失11.3個百分點。盡管KP和GL蒸煮過程中總的碳水化合物損失較多，但聚葡萄糖的損失并不多，聚木糖、聚甘露糖、聚阿拉伯糖和聚半乳糖的降解和溶出率相對較高，尤其是聚半乳糖和聚甘露糖，損失均超過原料中含量的60%，聚木糖和聚阿拉伯糖的降解溶出也達到30%左右。

表2 原料及其蒸煮、氧脫木素后漿料的化學(xué)組成 %

注 均相對原料。

從表2結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，KP和GL蒸煮后的漿料再進行氧脫木素，隨著木素含量的降低，碳水化合物含量也有不同程度的下降。對于KP蒸煮樣品，采用NaOH作堿性介質(zhì)氧脫木素時聚糖降解稍多，其中聚葡萄糖降解約4個百分點。而GL蒸煮樣品氧脫木素時，堿性介質(zhì)的種類對聚糖降解的影響不大，聚葡萄糖降解均較少。

2.2 預(yù)處理樣品酶解單糖轉(zhuǎn)化

用Ctec2對蒸煮及氧脫木素樣品進行酶解，采用單糖得率和總單糖提取率對酶解效果和整個工藝過程糖的轉(zhuǎn)化進行評價。單糖得率定義為酶解得到的單糖總量占酶解前底物質(zhì)量的百分比；總單糖提取率指酶解得到的單糖總量占木片原料中聚糖總量的百分比。在計算這兩個評價指標時所用到的單糖量均轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的聚糖量再進行計算。圖1和圖2顯示的是不同預(yù)處理樣品酶解后單糖得率比較。

注 R表示打漿處理，下同。圖1 GL蒸煮及其氧脫木素漿酶解單糖得率

圖2 KP蒸煮及其氧脫木素漿酶解單糖得率

比較單糖得率可知，蒸煮后未經(jīng)氧脫木素的樣品，酶解后單糖得率均較低，GL蒸煮后再經(jīng)打漿處理的樣品，當酶用量為5 FPU/g和10 FPU/g時，相應(yīng)的單糖得率僅為16.4%和26.1%。KP蒸煮漿料相應(yīng)的單糖得率高于GL漿，但也只有36.9%和48.2%。上述兩個樣品經(jīng)不同條件氧脫木素后，均可明顯提高酶解單糖得率，提高的幅度因氧脫木素條件以及有無打漿處理而異。與NaOH相比，Na2CO3作堿性介質(zhì)的氧脫木素樣品酶解效率似乎更高。譬如樣品GL-O-R和GL-OC- 10-R，其木素含量相近(20.9%和20.0%)，在酶用量為5 FPU/g、10 FPU/g時，單糖得率分別為43.9%、59.8%和60.7%、73.2%。再比較KP-O-R(木素含量12.7%)和 GL-OC- 10-R(木素含量20.0%)發(fā)現(xiàn)，盡管后者木素含量較高，其酶解單糖得率(10 FPU/g 時73.2%)卻高于前者(10 FPU/g 時67.0%)。對于KP蒸煮的漿料，由于在Na2CO3堿性介質(zhì)中木素脫出率高，其酶解底物木素含量相對較低，因此酶解效果優(yōu)于NaOH介質(zhì)氧脫木素的漿料。Na2CO3用量10%的氧脫木素漿料，當酶用量為5 FPU/g和10 FPU/g時，單糖得率分別比NaOH氧脫木素高33.7和27.2個百分點。上述結(jié)果除了得益于Na2CO3氧脫木素可更多降低木素含量外，推測Na2CO3氧脫木素樣品更易打漿，增加酶的可及度，因此相近甚至更高木素含量時其酶解效率依然高于NaOH氧脫木素漿。此外，無論KP還是GL蒸煮，氧脫木素漿料經(jīng)打漿處理后，酶解單糖得率均高于未打漿處理的樣品。已經(jīng)有很多關(guān)于打漿處理對酶解影響的研究[12]，本研究的結(jié)果再次驗證了打漿對酶解的促進作用。

根據(jù)前述定義，酶解單糖得率僅反映預(yù)處理對底物酶解效果的改善情況，一個好的預(yù)處理技術(shù)不僅能夠促進后續(xù)酶的作用，預(yù)處理過程本身應(yīng)盡可能將聚糖保留下來，從而提高整個生物乙醇生產(chǎn)過程中總的單糖提取率。只有總的單糖提取率足夠高，預(yù)處理及酶解技術(shù)才有可能實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。圖3和圖4顯示的是酶解得到的總單糖相對于原料中聚糖的提取率，比較發(fā)現(xiàn)，不同樣品之間總單糖提取率的相對高低與單糖得率并不一致，即酶解單糖得率高的樣品其總單糖提取率未必高。譬如對于KP-OC漿，無論打漿與否，Na2CO3用量20%所得樣品的單糖得率均高于相應(yīng)Na2CO3用量10%的樣品(圖2)，而樣品對應(yīng)的總單糖提取率則相反，Na2CO3用量10%的總單糖提取率反而高于20%Na2CO3用量的樣品(圖4)。無論GL還是KP蒸煮，Na2CO3用量10%時氧脫木素樣品酶解總單糖提取率分別最高，酶用量10 FPU/g時分別可達72.4%和75.7%(圖3和圖4)。本課題組曾對KP預(yù)處理后樣品的NaOH氧脫木素工藝進行了優(yōu)化，火炬松原料經(jīng)優(yōu)化的條件處理后，總單糖提取率可達60%左右[18]，Na2CO3氧脫木素樣品酶解總單糖提取率明顯高于前者。此外，打漿處理對于Na2CO3用量低的樣品酶解效果的提高更加明顯，可能是因為Na2CO3用量低的樣品殘留的木素較多，打漿處理使纖維素更多地暴露于酶液中，因而更有利于酶解效率的提高。

圖3 GL蒸煮及其氧脫木素漿總單糖提取率

圖4 KP蒸煮及其氧脫木素漿總單糖提取率

圖5和圖6顯示的是原料中4種聚糖酶解后分別轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵單糖的情況，在此稱之為提取率?？梢姡瑹o論哪種蒸煮方式，預(yù)處理后的樣品酶解后，聚葡萄糖的提取率均比較高，最高可達88%；其次是聚木糖，最高可達67%；聚甘露糖的轉(zhuǎn)化率相對較低，最高可達30%左右；聚半乳糖的轉(zhuǎn)化率更低，最高只有13%左右；此外，酶解液中幾乎檢測不到阿拉伯糖。從表2數(shù)據(jù)可知，原料中的聚阿拉伯糖含量本來就很低，加之預(yù)處理過程中有所損失，所以酶解提取得到的非常少。從前述蒸煮和氧脫木素后漿料中各聚糖變化情況可知，無論是KP還是GL蒸煮，原料中的聚葡萄糖損失并不是特別多，損失最多的是聚甘露糖和聚木糖，這兩種聚糖在原料中所占的比例相對較高，其損失會直接影響總單糖提取率，因此盡管聚葡萄糖提取率很高，但總單糖提取率最高只能達到75%左右。與圖3和圖4中總單糖提取率的規(guī)律一致，原料中的各種聚糖，其轉(zhuǎn)化情況也因預(yù)處理和酶解條件不同而異，但幾乎每一種聚糖，都是Na2CO3作為堿性介質(zhì)氧脫木素樣品的提取率比較高。

圖5 KP蒸煮及氧脫木素樣品酶解后原料中4種聚糖的提取率

圖6 GL蒸煮及氧脫木素樣品酶解后原料中4種聚糖的提取率

與KP漿相比，GL漿氧脫木素后總的木素脫出率較低，相應(yīng)的聚糖損失也較少，所以盡管樣品酶解過程單糖得率較低，但相對于原料中的聚糖，可發(fā)酵單糖的提取率最高可達72.4%(圖3)，僅比相同氧脫木素條件的KP漿的總單糖提取率低3.3個百分點。當Na2CO3用量為20%時，未經(jīng)打漿處理的GL和KP氧脫木素樣品的酶解總單糖提取率幾乎相同，分別為68.7%和68.5%(圖3和圖4)。與NaOH氧脫木素相比，由于Na2CO3作為堿性介質(zhì)氧脫木素選擇性更好，所以能保留更多的聚糖，酶解后總單糖提取率明顯優(yōu)于NaOH為堿性介質(zhì)的氧脫木素樣品。GL蒸煮的樣品，Na2CO3用量10%氧脫木素后，當酶用量分別為5 FPU/g和10 FPU/g時，相應(yīng)的酶解總單糖提取率分別比NaOH用量5%的樣品高11.8和6.7個百分點(圖3)。相似的，KP蒸煮漿料在Na2CO3用量10%氧脫木素后，當酶用量分別為5 FPU/g和10 FPU/g時，相應(yīng)的總單糖提取率分別比NaOH用量5%的樣品高28和23個百分點(圖4)。可見，用Na2CO3作為堿性介質(zhì)延長時間進行氧脫木素可大大提高聚糖的保留率，從而提高總單糖提取率。綜合考慮整個工藝過程和酶解效果，KP蒸煮輔以Na2CO3氧脫木素優(yōu)勢更加明顯。

3 結(jié) 論

以往研究發(fā)現(xiàn)，對于比較難處理的針葉材原料，采用堿法預(yù)處理輔以氧脫木素及后續(xù)打漿處理可明顯提高預(yù)處理漿料的酶解效率，但以NaOH為堿性介質(zhì)的氧脫木素過程仍會損失較多的聚糖，導(dǎo)致總糖提取率偏低。本研究結(jié)果表明，氧脫木素時將NaOH堿性介質(zhì)改為Na2CO3，并且延長脫木素反應(yīng)時間，不僅能夠進一步提高木素脫出率和脫木素選擇性，而且氧脫木素后漿料更易于打漿和酶解，最終可有效提高原料中總糖至可發(fā)酵單糖的轉(zhuǎn)化率。

參 考 文 獻

[1] Faaij A. Modern biomass conversion technologies[J]. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 2006, 11(2): 343．

[2] Ragauskas A J, Williams C K, Davison B H, et al. The path forward for biofuels and biomaterials[J]. Science, 2006, 311(5760): 484．

[3] Bozell J J. Feedstocks for the future-Biorefinery production of chemicals from renewable carbon[J]. Clean, 2008, 36(8): 641．

[4] Regalbuto J R. Cellulosic biofuels-Got gasoline？[J]. Science, 2009, 325(5942): 822．

[5] Tilman D, Socolow R, Foley J A, et al. Beneficial biofuels-The food, energy, and environment trilemma[J]. Science, 2009, 325(5938): 270．

[6] Zhang P Y H, Himmel M, Mielenz J. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies[J]. Biotechnology Advances, 2006, 24(5): 452．

[7] Kumar L, Tooyserkani Z, SokhansanjS, et al. Does densification influence the steam pretreatment and enzymatic hydrolysis of softwoods to sugars？[J]. Bioresource Technology, 2012, 121(10): 90．

[8] Rana D, Rana V, Ahring K B. Producing high sugar concentrations from loblolly pine using wet explosion pretreatment[J]. Bioresource Technology, 2012, 121(10): 61．

[9] Ewanick S M, Bura R, Saddler J N. Acid-catalyzed steam pretreatment of lodgepole pine and subsequent enzymatic hydrolysis and fermentation to ethanol[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 98(4): 738．

[10] Sassner P, Galbe M, Zacchi G. Steam pretreatment ofSalixwith and without SO2impregnation for production of bioethanol[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2005, 124(1/2/3): 1101．

[11] Wu S, Chang H, Jameel H, et al. Novel green liquor pretreatment of loblolly pine chips to facilitate enzymatic hydrolysis into fermentable sugars for ethanol production[J]. Journal of Wood Chemistry and Technology, 2010, 30(3): 205．

[12] Koo B, Treasure H, Jameel H, et al. Reduction of enzyme dosage by oxygen delignification and mechanical refining for enzymatic hydrolysis of green ligquor-pretreated hardwood[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011, 165: 832．

[13] Hakola M, Kallioinen A, Kemell M, et al. Liberation of cellulose from the lignin cage: A catalytic pretreatment method for the production of cellulosic ethanol[J]. Chem Sus Chem, 2010, 3(10): 1142．

[14] Pan X, Xie D, Yu R W, et al. Pretreatment of lodgepole pine killed by mountain pine beetle using the ethanol organosolv process: Fractionation and process optimization[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2007, 46(8): 2609．

[15] Ko J K, Bak J S, Jung M, et al. Ethanol production from rice straw using optimized aqueous ammonia soaking pretreatment and simultaneous saccharification and fermentation[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(19): 4374．

[16] Zhu J Y, Pan X J, Wang G S, et al. Sulfite pretreatment(SPORL) for robust enzymatic saccharification of spruce and red pine[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(8): 2411．

[17] Salehian P, Karimi K, Zilouei H, et al. Improvement of biogas production from pine wood by alkali pretreatment[J]. Fuel, 2013, 106(4): 484．

[18] Zhang H, Wu S. Enhanced enzymatic cellulose hydrolysis by subcritical carbon dioxide pretreatment of sugarcane bagasse[J]. Bioresource Technology, 2014, 158(4): 161．

[19] Wu S, Jameel H, Chang H, et al. Techno-economic analysis of the optimum softwood lignin content for the production of bioethanol in a repurposed kraft mill[J]. BioResources, 2014, 9(4): 6817．

[20] Ghose T K. Measurement of cellulase activities[J]. Pure and Applied Chemistry, 1987, 59(2): 257．

[21] Ghose T K. Measurement of hemicellulose activities Part 1: xylanase[J]. Pure and Applied Chemistry, 1987, 59(12): 1739．

[22] Sluiter A, Hames B, Ruiz R, et al. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytical Procedure, 2008, NREL, Report No. TP- 510- 42618[S].