成人與兒童分泌性中耳炎中耳積液中耳炎差異球菌對(duì)比分析

鄧欣欣 梁耕田 盧嶺 劉莉 楊麗萍 金輝 鄧歡歡

分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)由于咽鼓管功能障礙和/或中耳黏膜分泌障礙所引起的以中耳腔負(fù)壓、積液為主要變化的臨床常見(jiàn)疾病，病程長(zhǎng)達(dá)8周以上者即為慢性SOM[1]。目前，細(xì)菌被公認(rèn)為是SOM的致病因素之一，最常見(jiàn)的致病菌為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌[2]。近20年來(lái)，在SOM患者中耳積液中又發(fā)現(xiàn)了一種新的主要致病菌，即耳炎差異球菌(alloiococeus otitidis)[3]，國(guó)內(nèi)尚缺乏對(duì)該菌進(jìn)行分離和鑒定的有效方法及將該細(xì)菌與上述三種最常見(jiàn)致病菌在成人與兒童SOM中對(duì)比的資料。故本研究擬通過(guò)分析上述四種細(xì)菌在成人與兒童慢性SOM中耳積液中的檢出率,探討其對(duì)成人及兒童SOM發(fā)生發(fā)展的意義，為臨床對(duì)SOM的針對(duì)性治療提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及分組 選取2013年5月1日～2013年12月30日耳鼻喉科就診、擬在全麻或局麻下行鼓膜置管術(shù)的SOM患者120例181耳為研究對(duì)象，其中男73例，女47例；雙耳61例，單耳59例。病程2個(gè)月～20年，年齡2～67歲，其中兒童(≤14歲)68例111耳(兒童組)，中耳積液稀薄組平均年齡為8.88±4.39歲，平均病程為8.26月±10.93，粘稠組平均年齡為7.49±3.38歲，平均病程為17.94±15.85月；成人(≥18歲)52例70耳(成人組)，中耳積液稀薄組平均年齡為40.03±17.03歲，平均病程為27.47月±41.85，粘稠組平均年齡為47.40±17.10歲，平均病程為35.59±59.11月。

納入標(biāo)準(zhǔn)[1]：①臨床癥狀：有聽(tīng)力下降、耳痛、耳內(nèi)閉塞感、耳鳴等癥狀；②體格檢查:鼓膜內(nèi)陷或膨隆，呈琥珀色、橙色或乳白色、灰藍(lán)色，部分可見(jiàn)液平面，鼓膜活動(dòng)差，部分見(jiàn)積液征；③純音聽(tīng)閾顯示傳導(dǎo)性聽(tīng)力損失，鼓室導(dǎo)抗圖為B型或C型；④中耳CT檢查符合SOM的影像改變；⑤排除鼻咽部新生物及嚴(yán)重心、肺、腦、腎臟疾患者，以及伴有消化道疾病者；⑥術(shù)前一周均未使用抗生素。

1.2中耳積液標(biāo)本收集及性狀分類 患者全麻或局麻后，消毒鋪單，清除外耳道耵聹，消毒外耳道，在顯微鏡下經(jīng)嚴(yán)格的無(wú)菌操作，用鼓膜切開(kāi)刀于鼓膜前下象限切開(kāi)鼓膜，用1 ml注射器采集中耳積液0.05～0.4 ml，平均0.1 ml；將積液性質(zhì)按外觀性狀分為漿液、黏液、漿-黏液三種[1]，本研究將漿液歸為稀薄組，黏液和漿-黏液歸為粘稠組。

1.3中耳積液標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng) 每例中耳積液標(biāo)本留樣兩份，一份取樣后立即送常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏；另一份置于-80 ℃冰箱中保存，待所有標(biāo)本收集完畢，按照隨機(jī)、雙盲的標(biāo)準(zhǔn)抽取標(biāo)本提取DNA。

1.4中耳積液標(biāo)本DNA的抽提及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 按一管式臨床樣品DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)的實(shí)驗(yàn)步驟提取DNA。在經(jīng)滅菌處理的50 μl PCR反應(yīng)管中，按PCR反應(yīng)體系加入試劑，根據(jù)4種不同的上游引物分別配制4個(gè)離心管，將樣品管放置于PCR儀中，按設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。取3 μl 10×上樣緩沖液，加入10 μl PCR產(chǎn)物中，混合后加入配制好的1%瓊脂糖凝膠電泳中，連接電泳儀，電壓為80 V，電泳30 min，于紫外透射儀下觀察產(chǎn)物，以瓊脂糖凝膠電泳成像分析儀觀察分析電泳結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Pearson卡方檢驗(yàn)比較分類數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1中耳積液常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 181耳中耳積液中僅5耳(2.77%，5/181)培養(yǎng)出流感嗜血桿菌，其中兒童4耳(3.6%，4/111)，成人1耳(1.4%，1/70)，所有標(biāo)本均沒(méi)有培養(yǎng)出耳炎差異球菌、肺炎鏈球菌和卡莫拉菌。

2.2中耳積液PCR檢測(cè)結(jié)果 181耳中耳積液中，共有75耳樣品檢測(cè)出細(xì)菌，PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1；在兒童組中耳積液中耳炎差異球菌的檢出率(42.3%)高于成人組(25.7%)(χ2=81.7，P<0.05)。

2.3不同性狀中耳積液的細(xì)菌檢出率比較 兒童組中耳積液稀薄51耳，粘稠60耳；成人組中耳積液粘稠24耳，稀薄46耳。在兒童SOM粘稠積液中耳炎差異球菌的檢出率為48.3%，稀薄積液中為35.3%，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.5，P>0.05)(表2)；在成人組粘稠積液中耳炎差異球菌的檢出率為58.4%，稀薄積液中為8.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.9，P<0.05)(表3)。

表1 中耳積液中主要致病菌在成人與兒童組中檢出率(耳，%)

表2 兒童組中耳積液中致病菌在不同積液性狀耳中的檢出率(耳，%)

可見(jiàn)，兒童組中耳積液稀薄耳中耳炎差異球菌的檢出率高于成人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.1，P<0.05)，兒童組中耳積液粘稠組中耳炎差異球菌的檢出率與成人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.2，P>0.05)。

3 討論

表3 成人組中耳積液中致病菌在不同積液性狀耳中的檢出率(耳，%)

耳炎差異球菌是Faden和Drgia于1989年在小兒SOM患者的中耳積液中發(fā)現(xiàn)的[4]；有研究[5，6]發(fā)現(xiàn)在2歲以上的SOM兒童的中耳積液中更頻繁地發(fā)現(xiàn)耳炎差異球菌。在體外實(shí)驗(yàn)中，該菌能激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞，且可致人類上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生Ⅲ一8、IL—12[6，7]，說(shuō)明該菌有一定的致病性。然而，耳炎差異球菌是否具有足夠的致病性從而引起SOM目前還未明確。

本研究采用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法，在兒童慢性SOM中耳積液的細(xì)菌檢出率為3.6%(4/111)，成人為1.4%(1/70)；采用PCR方法檢測(cè)時(shí)，兒童組中耳積液細(xì)菌檢出率為51.3%，成人組為25.7%，其中耳炎差異球菌的檢出率分別為42.3%和25.7%；說(shuō)明不論是成人還是兒童患者，在檢測(cè)耳炎差異球菌和其他三種主要病原體方面，PCR方法比細(xì)菌培養(yǎng)方法更有效，與文獻(xiàn)報(bào)道[8～13]一致。因?yàn)槎撞町惽蚓L(zhǎng)最適溫度為37 ℃，生長(zhǎng)緩慢，無(wú)氧或45 ℃時(shí)不生長(zhǎng)，而且需要一種特殊的介質(zhì)[8]，因此用常規(guī)培養(yǎng)方法在中耳積液和鼻咽部分泌物中很難檢測(cè)到耳炎差異球菌；而PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使細(xì)菌的DNA迅速擴(kuò)增，因此PCR方法比常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法能夠更靈敏地檢測(cè)出細(xì)菌。

從文中結(jié)果看，采用PCR方法檢測(cè)時(shí)，成人和兒童組耳炎差異球菌的檢出率比其他三種主要病原體都高，是主要的致病菌，且耳炎差異球菌在兒童組中的檢出率(42.3%)高于成人組(25.7%)，與既往研究一致[13,14]。因此推測(cè)，耳炎差異球菌與兒童慢性SOM的發(fā)病機(jī)制可能有更明顯的關(guān)系，其機(jī)理可能如下：耳炎差異球菌感染中耳后，其抗原及內(nèi)毒素經(jīng)過(guò)經(jīng)典、替代途徑激活補(bǔ)體，趨化聚集中性粒細(xì)胞及吞噬細(xì)胞，引起血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增高，加之生理和解剖上的咽鼓管功能障礙，影響兒童和成人患者中耳積液的引流；而成人患者中耳炎差異球菌可能通過(guò)I型變態(tài)反應(yīng)，產(chǎn)生抗中耳內(nèi)膜抗體，使中耳內(nèi)膜產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，繼而形成無(wú)菌滲出，這可能是成人SOM后期細(xì)菌消失，中耳積液卻長(zhǎng)期存在的原因之一[15]。

有研究[14]表明在某些情況下(如病程長(zhǎng))慢性SOM稀薄的中耳積液可轉(zhuǎn)為粘稠積液，甚至發(fā)展為粘連性中耳炎，導(dǎo)致患者持久地聽(tīng)力減退，甚至發(fā)生鼓膜萎縮、鼓室硬化、慢性中耳炎、膽脂瘤、膽固醇肉芽腫等。有研究[16]認(rèn)為SOM患者中耳積液中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)耳炎差異球菌的DNA,其與疾病的持久性有關(guān)，如果急性SOM階段沒(méi)有消滅耳炎差異球菌或者耳炎差異球菌存在于細(xì)菌生物膜中，可能會(huì)導(dǎo)致慢性感染。本組對(duì)象中成人組粘稠中耳積液中耳炎差異球菌的檢出率為58.4%(14/24)，稀薄中耳積液中的檢出率為8.7%(4/46)，顯示更易在粘稠的中耳積液中檢測(cè)到耳炎差異球菌，可能耳炎差異球菌與成人慢性SOM的病情發(fā)展有關(guān)，耳炎差異球菌更多的代表了慢性SOM階段；這與Leskinen等(2004)的研究報(bào)告一致，他認(rèn)為在中耳滲出液中耳炎差異球菌的存在與較長(zhǎng)的中耳炎病程有關(guān)。而文中結(jié)果顯示兒童SOM患者中耳積液粘稠組和稀薄組的耳炎差異球菌檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)耳炎差異球菌可能對(duì)兒童慢性O(shè)ME中耳積液性狀影響不大。推測(cè)在成人SOM患者中，耳炎差異球菌產(chǎn)生的毒素可能引起中耳粘膜結(jié)締組織增厚，并破壞正常的粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，使中耳積液蓄積，導(dǎo)致SOM遷延不愈。

耳炎差異球菌能夠刺激上皮細(xì)胞、體外的T淋巴細(xì)胞以及腺樣淋巴細(xì)胞的混合種群，研究[14]認(rèn)為中耳腔是一個(gè)獨(dú)立的免疫器官，細(xì)菌和病毒感染通過(guò)直接或間接途徑激活中耳腔的補(bǔ)體系統(tǒng)，趨化炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促使炎性介質(zhì)釋放。SOM后期，雖然中耳積液中已無(wú)病原微生物存在，但各種炎性介質(zhì)，如：干擾素—a(IFN—a)等濃度繼續(xù)增高，從而趨化白細(xì)胞，抑制抗體生成，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放氧化氫、氧自由基，使炎癥反應(yīng)繼續(xù)，甚至進(jìn)一步加劇，導(dǎo)致鼓室組織損傷，積液長(zhǎng)期存在；但耳炎差異球菌侵入中耳后如何導(dǎo)致疾病的持久性，機(jī)制尚不清楚。

無(wú)論是成人還是兒童，耳炎差異球菌均可能是SOM的主要致病菌，且可能與慢性SOM發(fā)病機(jī)制有關(guān)，未來(lái)工作中，需要更深入了解耳炎差異球菌在SOM的慢性發(fā)展中的作用，以能夠指導(dǎo)臨床治療。

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