超聲造影評估早期骨再生血管化的實驗研究

劉幫燕，金 琳，夏 晴，王迎春

(1. 濰坊醫(yī)學院，山東濰坊261000；2. 上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院，上海201800)

0 引 言

骨缺損、骨不連或延遲愈合是臨床關注的難題。再血管化、骨再生、骨端融合是骨再生過程中三個密切相關的環(huán)節(jié)，其中再血管化是最基本的環(huán)節(jié)，往往對骨再生、骨愈合的方式和效果產(chǎn)生決定性的影響。研究表明，血供是骨再生的前提，具有維持骨的生長、重建及其生理功能的作用[1]，因此早期檢測血管化對評估骨再生不良及骨折患者預后有重要價值[2]。超聲造影(Contrast Enhanced Ultrasound，CEUS)可實時顯示組織內(nèi)微血管及血流灌注情況，對組織內(nèi)微血管進行實時動態(tài)觀察、定量分析，彌補了彩色多普勒超聲在檢測微血管方面的不足，已在臨床各個領域得到廣泛應用[3-6]，但將其用于評估移植骨早期血管化程度的研究，國內(nèi)外尚少有報道[7]。本研究通過建立骨再生模型，采用CEUS觀察早期骨再生新生血管形成情況，旨在探討CEUS在早期骨再生過程中用于監(jiān)測骨移植材料血管化的價值，以期為骨缺損、骨不連或延遲愈合的臨床早期干預提供可靠的影像學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物為SD級大鼠25只，雄性，4周齡，體質(zhì)量 200～250 g，(平均 225g)。超聲造影劑為Bracco Sono Vue(含六氟化硫氣體 59 mg)，CPC/rhBMP-2復合材料由上海瑞邦生物材料有限公司生成。

1.2 動物模型

實驗組于大鼠左側后肢剃毛、消毒， 經(jīng)皮膚、皮下，分開肌肉，將 CPC/rhBMP-2植入大鼠左側肌間隙內(nèi)，逐層縫合傷口，術后正常喂養(yǎng)。

1.3 實驗分組

將大鼠按術后3、7、14、21、28 d分為5組，每組5只。

1.4 實驗方法

采用東芝Aplio 400型彩色多普勒超聲診斷儀，隨機配備CEUS成像軟件，14-L5探頭，探頭頻率為14 MHz，低機械指數(shù)0.13，檢查時儀器參數(shù)設置一致。二維高頻超聲觀察支架(支架在大鼠左側肌間隙。方法：腹腔麻醉后，將大鼠左側后肢剃毛、消毒，用眼科剪切開皮膚、筋膜以暴露其后肢大腿處肌肉，并鈍性分離其肌間隙，將 CPC/rhBMP-2支架埋入大鼠左側肌間隙內(nèi)。支架就是 CPC/rhBMP-2)的大小、回聲及形態(tài)。選取高頻超聲觀察到支架的最佳切面，啟動造影模式進行檢查。將造影劑SonoVue(59 mg)和5.0 ml生理鹽水混合，人工震蕩混搖勻至白色乳狀微泡懸濁液，使用劑量為0.1 ml.kg-1體質(zhì)量，經(jīng)尾靜脈注入，隨后立即注入1 ml生理鹽水，注射造影劑同時啟動計時器，檢查時保持探頭不動，觀察支架周邊及內(nèi)部造影劑的增強強度，連續(xù)觀察 2 min，并存儲動態(tài)影像。根據(jù)支架的大小和形狀，逐幀手動調(diào)整感興趣區(qū)(Region Of Interest，ROI)，于支架周圍肌組織勾勒另一ROI作為參考區(qū)，應用時間-強度曲線(Time-Intensity Curve，TIC)分析造影劑灌注參數(shù)，包括達峰 PI、TTP、AUC。

1.5 病理學檢測

術后3、7、14、21、28 d對植入部位取材，將材料連同周圍肌肉一同取出。10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，切片厚度為5 μm，HE染色，觀察支架內(nèi)新生毛細血管數(shù)及成骨情況，計算切片下新生血管的面積占切片總面積的百分比，用來表示新生血管百分數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。采用單因素方差分析比較各時間點超聲檢查結果存在的差異，以p＜ 0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 超聲結果

二維超聲顯示，各觀察時間點支架大小未見明顯改變。術后 3 d，支架呈高回聲，內(nèi)可見孔隙結構；術后7 d、14 d，支架回聲較前期增強，邊界欠光整，但孔隙仍清晰可見；術后21、28 d，支架回聲明顯增強，形態(tài)欠規(guī)則，孔隙逐漸模糊。

圖2 術后 7 d，支架周邊造影劑已向中間填充Fig.2 CEUS imaging on the 7th day

CEUS顯示，術后3 d，周邊可見點狀造影劑灌注，內(nèi)部無明顯造影劑灌注(見圖1)；術后7 d，周邊及內(nèi)部均可見造影劑灌注(見圖2)，PI及AUC較3 d增加明顯(見表1)；術后14 d，周邊及內(nèi)部均見造影劑明顯灌注，PI及AUC達最大值(見圖3)；術后21 d及28 d，支架周邊及內(nèi)部造影劑灌注量明顯降低，PI及AUC較術后14 d減低，28 d時顯著減少(見圖4)，各組間PI、AUC差異有統(tǒng)計學意義(檢驗統(tǒng)計量F=104.50，p=0.000；F=223.99，p=0.000)，但TTP差異無明顯統(tǒng)計學意義(F=1.760，p=0.177)。

表1 各時間CEUS所測CPC/rhBMP-2內(nèi)PI、AUC、TTP值(n=25)Table 1 PI、 AUC、TTP in CPC/rhBMP-2 was measured with CEUS in different observation days (n=25 )

圖3 術后14 d，支架周邊及內(nèi)部均見大量造影劑灌注Fig.3 CEUS imaging on the 14th day

圖4 術后28 d，支架周邊及中央造影劑灌注區(qū)明顯減少，灌注面積低于術后14 dFig.4 CEUS imaging on the 28th day

2.2 病理學結果

大體標本觀察，術后 3 d，支架外周未見肌組織包裹，內(nèi)孔隙清晰；術后7 d支架外周見少量肌組織包裹，內(nèi)孔隙仍清晰可見，術后14 d，支架與周圍肌組織結合緊密，外周肌組織增多，孔隙模糊，支架邊界欠光整；術后21 d，支架外周除肌組織外，還可見少量淡黃色組織；術后28 d，支架外周肌組織及淡黃色組織增多，形態(tài)欠規(guī)則。整個實驗過程，材料大小未發(fā)生明顯變化。

HE染色顯示，術后3 d，支架周邊可見少量炎性細胞和新生血管萌芽，部分樣本可見未分化的間充質(zhì)細胞在植入部位和鄰近肌組織之間增殖(見圖5)；術后7 d，支架周邊可見排列紊亂的新生血管逐步向中央填充，外周可見大量增生的間充質(zhì)細胞(見圖6)；術后14 d，支架外周及內(nèi)部可見新生毛細血管顯著增多，達到最高水平，外周及內(nèi)部出現(xiàn)少量骨樣組織，但主要集中在外周孔隙(見圖7)；術后21 d，支架內(nèi)新生血管逐漸減少，趨向成熟，周邊及內(nèi)部可見大量間充質(zhì)細胞及骨細胞，可見少量未成熟的骨組織逐步向支架內(nèi)長入；術后28 d，支架周圍及內(nèi)部新生血管減少，外周新生骨趨于成熟(見圖8，表2)。

圖5 術后3 d，支架周邊可見少量新生血管Fig.5 Pathological image on the 3rd day

圖7 術后14 d，支架周邊及內(nèi)部均可見大量新生血管，可見少量未成熟的骨組織Fig.7 Pathological image on the 14th day

圖8 術后28 d，可見新生血管明顯減少并趨向成熟，可見少量成熟的骨組織。Fig.8 Pathological image on the 28th day

表2 各時間HE染色新生血管數(shù)Table 2 The number of new blood vessels with HE staining in different observation days

3 討 論

骨骼生長、修復和骨重塑是一系列嚴格依賴于新生毛細血管快速生長的生物事件，血管網(wǎng)絡在骨生成過程中除提供營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、激素、細胞因子和趨化因子，清除代謝產(chǎn)物外，還發(fā)揮了溝通骨與鄰近組織之間的作用，從而達到骨修復的目的[8-9]，反之，血管化不足將限制營養(yǎng)物質(zhì)的攝取及代謝產(chǎn)物的排出[10]，從而表現(xiàn)為延遲愈合和不愈合，表明骨組織的生成與血管生成是緊密聯(lián)系的過程，因此，評估移植骨血管化在骨再生過程顯得尤為重要。目前檢測血管化的影像學方法包括放射性骨顯像、CT灌注成像及磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)。其中，放射性骨顯像可反映局部骨骼的血供，有助于評價新生骨的成熟度；CT灌注成像可在毛細血管水平上準確反映局部的血管生成[11]，但兩者由于輻射性較大，限制了其在臨床的應用；MRI以軟組織分辨率高、無創(chuàng)、無輻射等優(yōu)點成為臨床評價移植骨植入后血管化的首選方法，其最大的不足在于，裝有心臟起搏器，人工金屬瓣膜或存在幽閉恐懼癥的患者不能接受MRI檢查[12]，且檢查時間過長，重復檢查費用較高，臨床不易接受。

CEUS是利用超聲造影劑觀察目標區(qū)域內(nèi)流動的微氣泡來顯示新生血管的生成情況，對微小血管顯示有較好的分辨力[13]。本研究應用CEUS動態(tài)觀察 CPC/rhBMP-2的早期新生血管形成情況并定量分析，結果顯示：術后 3 d，支架周邊有少量造影劑灌注，內(nèi)部無灌注，病理結果顯示支架周邊可見少量新生血管細胞；隨著時間增加，造影劑逐步向支架內(nèi)部延伸，術后14 d內(nèi)部造影劑PI、AUC均達到最高水平，病理結果同樣顯示支架周邊及內(nèi)部新生血管密度最高，說明支架內(nèi)新生血管達到頂峰，與Rabie等[14]下頜骨術后觀察血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)水平的結果相符；術后21、28 d，支架周邊及內(nèi)部造影劑灌注量明顯下降，但周邊部灌注量多于支架內(nèi)部，PI、AUC逐步降低，可能與支架內(nèi)成骨細胞增多而血管退化有關，而二維超聲顯示支架形態(tài)欠規(guī)則，內(nèi)孔隙結構模糊，回聲反射明顯增強，后方出現(xiàn)衰減，表明支架內(nèi)已有新生骨形成，與病理結果顯示支架外周及內(nèi)部均可見骨組織及骨小梁的形成一致，但骨組織的分布趨勢仍以外周為主，與新生血管的形成趨勢一致，這與Wang等[15]將支架植入后，發(fā)現(xiàn)新生血管的形成及鈣的沉積是從支架周邊逐漸向中央推進的一個過程相符。在CEUS定量分析中還發(fā)現(xiàn)各時期TTP間并無差異，與凌茵等[5]利用CEUS觀察珊瑚羥基磷灰石(CHA)內(nèi)血管化的研究發(fā)現(xiàn)(TTP與時間呈顯著負相關)不符，考慮是由于支架種類或血管同源性有關。上述研究結果表明，CEUS不僅可動態(tài)觀察不同時期CPC/rhBMP-2血管化情況，與組織病理學檢測高度一致，而且聯(lián)合常規(guī)超聲可觀測骨化過程。但CEUS仍存在不足，當骨成熟后，超聲波無法穿透高密度骨界面而造成成像困難。

綜上所述，本研究通過CEUS動態(tài)觀察支架內(nèi)新生血管的形成，發(fā)現(xiàn)其與病理學所顯示的血管分布一致，與骨組織早期生成密切相關。CEUS以其動態(tài)實時之優(yōu)勢揭示了血管形成方式、血管形成的達峰時期，而優(yōu)于其他影像學檢查方式，為評價早期移植材料內(nèi)的血管化及骨再生不良的早期干預提供可靠方法。總之，隨著超聲影像學及超聲造影劑的發(fā)展，CEUS技術將在骨組織工程中展現(xiàn)出更加廣闊的應用前景。

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