腦膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物IDH1、IDH2、p53基因突變和Ki-67蛋白表達(dá)與病理分級(jí)臨床特征的關(guān)系

孫怡 李惠 吳頤 李健 申龍樹(shù) 王耀輝 王劍蓉 章宜芬

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院1病理科/國(guó)家中醫(yī)藥管理局分子生物學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，2神經(jīng)外科（南京 210029）

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率約占原發(fā)性腦腫瘤的40%～50%左右，而且呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。近年來(lái)，分子標(biāo)記物檢測(cè)作為補(bǔ)充診斷依據(jù)、預(yù)測(cè)預(yù)后疾病的手段，極大推進(jìn)了原有的單純組織學(xué)分類。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、異檸檬酸脫氫酶 2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH2）基因是膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)，已有大量研究表明，該基因突變是膠質(zhì)瘤的一個(gè)獨(dú)特類型。國(guó)外研究報(bào)道IDH1突變好發(fā)于年輕膠質(zhì)瘤患者，早于p53基因突變的發(fā)生，是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的早期分子事件，IDH1突變的患者預(yù)后相對(duì)較好；國(guó)內(nèi)研究報(bào)道IDH在少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤和混合性膠質(zhì)瘤中突變較高，這均表明IDH基因可能成為新的治療靶點(diǎn)。傳統(tǒng)病理分型中的該基因型特征研究較少，本研究通過(guò)研究傳統(tǒng)病理分型中該基因的特征及分布規(guī)律，為膠質(zhì)瘤分子病理學(xué)分類提供新的依據(jù)，也為臨床治療和新藥開(kāi)發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2016年12月我院手術(shù)切除、臨床資料完整腦膠質(zhì)瘤樣本46例。其中男25例，女21例，年齡12～73歲，中位年齡50.0歲。根據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類分級(jí)，兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)診，共有Ⅰ級(jí)1例，Ⅱ級(jí)10例，Ⅲ級(jí)12例，Ⅳ級(jí)23例。以5例同期手術(shù)的腦膜瘤樣本作為陰性對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 IDH1、IDH2基因，p53基因突變檢測(cè) 根據(jù)HE染色切片確認(rèn)膠質(zhì)瘤腫瘤區(qū)域并刮取相應(yīng)白片腫瘤組織，按操作手冊(cè)（Qiagen GeneRead DNA FFPE kit，德國(guó)）提取DNA。PCR擴(kuò)增后凝膠電泳觀察產(chǎn)物是否為目的條帶，利用Bigdye Terminator（v3.1）進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，產(chǎn)物上ABI 3500型基因分析儀（ABI公司，美國(guó)）正反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Seqscape軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)分析IDH1基因R132位點(diǎn)、IDH2基因R172位點(diǎn)以及p53基因第5～8外顯子突變狀態(tài)，具體引物序列如下：IDH1上游：5′-TGTGGAAATCACCAAATGGCAC-3′；IDH1 下 游 ：5′-ACATACAAGTTGGAAATTTCTGGGC-3′；IDH2 上游：5′-TCCCAATGGAACTATCCGGAAC-3′；IDH2 下 游 ：5′-GACAAGAGGATGGCTAGGCG-3′；p53-exon5-6上游：5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′；p53-exon5-6下游：5′-CAAATAAGCAGCAGGAGAAAGC-3′；p53-exon7上游：5′-TTGCCACAGGTCTCCCCAAG-3′；p53-exon7 下游：5′-GTCCCAAAGCCAGAGAAAAG-3′；p53-exon8上游：5′-AGGACAAGGGTGGTTGGGAG-3′；p53-exon8 下 游 ：5′-TGGGCAGTGCTAGGAAAGAG-3′。

1.2.2 Ki-67蛋白表達(dá)檢測(cè) 鼠抗人Ki-67蛋白一抗、試劑盒及顯色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，免疫組化染色采用SP法。樣本常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋，切3 μm薄片，脫蠟水化，在微波爐中用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中100℃抗原修復(fù)15 min，PBS沖洗后用雙氧水阻斷15 min，沖洗后用羊血清室溫下阻斷40 min，加入一抗，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗后，加入二抗，37℃，40 min，PBS沖洗后，DAB顯色。結(jié)果判讀：由我院病理科醫(yī)師對(duì)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行評(píng)價(jià)，參照《邁新免疫和分子病理學(xué)產(chǎn)品目錄》抗體表達(dá)特定，以細(xì)胞核中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色信號(hào)為陽(yáng)性細(xì)胞，選取腫瘤細(xì)胞豐富、陽(yáng)性細(xì)胞較多的熱點(diǎn)區(qū)域，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞平均占比（%），參考文獻(xiàn)［3］報(bào)道以≤30%判為低表達(dá)，＞30%判為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)數(shù)資料表示為多個(gè)樣本率（構(gòu)成比），應(yīng)用SPSS 24.0軟件，采用χ2或Fisher精確概率法檢驗(yàn)IDH1突變與臨床特征（性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、WHO分級(jí)等）以及分子標(biāo)志物Ki-67表達(dá)的差異性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤樣本W(wǎng)HO分類分級(jí) 包括胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤（WHOⅠ級(jí)）1例，星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）5例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）4例，少突星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）1例，間變型星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級(jí)）7例，間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（WHOⅢ級(jí)）3例，間變型少突星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級(jí)）2例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)）23例（其中3例為繼發(fā)）。發(fā)生部位：額葉19例，其他部位27例。見(jiàn)圖1。

2.2 IDH1、IDH2突變檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)32.6%（15/46）的樣本發(fā)生IDH1基因突變，均位于第132位密碼子（c.G395A，p.R132H），見(jiàn)圖2，未發(fā)現(xiàn)IDH1基因其他突變類型和IDH2基因突變。IDH1基因突變與各項(xiàng)臨床病理特征間的關(guān)系見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)顯示，較低年齡（P＝0.028）、腫瘤位置發(fā)生于額葉（P＝0.002）、WHOⅡ-Ⅳ級(jí)組織學(xué)分級(jí)（P＝0.047）、Ki-67蛋白低表達(dá)（r＝-0.313，P＝0.034）均與IDH1基因突變顯著相關(guān)。而患者性別、腫瘤最大徑與IDH1基因是否突變無(wú)顯著性相關(guān)。突變型樣本中男10例，女5例，年齡12～62歲，中位年齡47.0歲；31例野生型樣本中男15例，女16例，年齡14～73歲，中位年齡53.0歲。不同WHO級(jí)別膠質(zhì)瘤之間IDH1基因突變陽(yáng)性率分別為：Ⅱ級(jí) 60%（6/10），Ⅲ級(jí) 41.7%（5/12），Ⅳ級(jí)17.4%（4/23，其中3例為繼發(fā)），突變率從低級(jí)別膠質(zhì)瘤到高級(jí)別膠質(zhì)瘤呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。73.3%（11/15）突變位于額葉。

2.3 p53基因突變檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)第5、6、7、8外顯子突變情況，發(fā)現(xiàn)4例標(biāo)本發(fā)生突變，突變位點(diǎn)主要位于第7、8外顯子，均診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)，25%），并伴IDH1野生型。見(jiàn)圖3。

2.4 Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況 Ki-67陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀。在46例膠質(zhì)瘤組織中，均有發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，其中低表達(dá)65.2%（30/46），高表達(dá)34.8%（16/46）。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中Ki-67表達(dá)見(jiàn)表2，WHOⅡ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤表達(dá)明顯升高，Ki-67表達(dá)與WHO分級(jí)成顯著線性正相關(guān)（r＝0.700，P＜ 0.001）。

圖1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤HE染色圖（×100）Fig.1 HE staining of different levels of gliomas（×100）

圖2 IDH1基因395位堿基G/A雜合突變Fig.2 Heterozygous 395G/A IDH1 mutation

表1 納入本研究患者臨床病理特征以及IDH1-R132H突變分布情況Tab.1 The relationship between IDH1-R132H mutation and clinical pathology

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤在神經(jīng)上皮性腫瘤中占60%，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤有不同發(fā)生機(jī)制，預(yù)后差別大。尋找相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)記有重要意義。2006年美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃對(duì)206例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤行高通量基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)IDH1或IDH2突變腫瘤生存期更長(zhǎng)［4-5］。2008年P(guān)ARSONS等［6］發(fā)現(xiàn) 12%的樣本發(fā)生 IDH1基因R132H突變；另有研究［7］發(fā)現(xiàn)IDH2同工酶基因R172位點(diǎn)也是膠質(zhì)瘤突變熱點(diǎn)。

圖3 p53基因突變圖Fig.3 Mutations in p53 gene

表2 Ki-67在WHOⅡ～Ⅳ級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)Tab.2 Ki-67 expression in WHOⅡ～Ⅳgliomas 例（%）

IDHl基因突變只在膠質(zhì)瘤的某些特定亞型中發(fā)生，其陽(yáng)性突變患者年齡更低，主要發(fā)生在彌漫性星形細(xì)胞瘤、少膠質(zhì)細(xì)胞瘤等（WHOⅡ級(jí)）和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)）［7-8］，提示這幾種腫瘤可能具有相同的起源途徑，有助于膠質(zhì)瘤的診斷分型和鑒別診斷。在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中，相對(duì)于IDH野生型，IDH基因突變的患者預(yù)后較好［9］，IDH突變狀態(tài)可以輔助診斷腦膠質(zhì)瘤。本研究檢出32.6%的樣本發(fā)生IDH1-R132H突變，發(fā)生于WHOⅡ～Ⅲ級(jí)的膠質(zhì)瘤，3例繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤均發(fā)生突變，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤無(wú)一檢出。較低年齡、腫瘤位置發(fā)生于額葉、WHOⅡ～Ⅳ級(jí)組織學(xué)分級(jí)、Ki-67蛋白低表達(dá)均與IDH1基因突變顯著相關(guān)。IDH1突變陽(yáng)性率從低級(jí)別（WHOⅡ級(jí)）到高級(jí)別（WHOⅣ級(jí)）顯著下降，提示膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與IDH1基因突變存在密切聯(lián)系。IDH1突變與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)，在疾病發(fā)生初始階段檢測(cè)IDH1基因突變狀態(tài)，輔助病理醫(yī)師診斷分級(jí)，協(xié)助臨床醫(yī)師制定合理治療方案，從而提高膠質(zhì)瘤治愈率。

WHO（2016）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類首次將分子檢測(cè)納入腦腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有組織學(xué)級(jí)別均應(yīng)首先檢測(cè)IDH突變狀態(tài)，以及1p/19q、ATPX、p53等基因變異情況。p53基因是一種抑癌基因［10］，80%～90%的腫瘤p53基因突變發(fā)生在中間區(qū)域（95-288密碼子）［11］。原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤p53陽(yáng)性率高于其他類型膠質(zhì)瘤，并與IDH1突變無(wú)相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)4例樣本p53基因突變，突變位點(diǎn)位于第7、8外顯子，均為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本伴IDH1野生型，或與腫瘤高度惡性相關(guān)，根據(jù)其分子分型（IDH1/2野生型，p53突變型）預(yù)后最差［9］。目前p53基因突變主要檢測(cè)方法是用突變型p53抗體免疫組化檢測(cè)，但p53免疫組化陽(yáng)性與p53基因突變二者之間的關(guān)系尚存爭(zhēng)議［11］，不能完全用p53突變型免疫組化抗體陽(yáng)性取代p53基因突變檢測(cè)。與國(guó)外報(bào)道相比［12］，本研究突變率偏低，或與中國(guó)人p53突變熱點(diǎn)差異性和入組樣本病理學(xué)分級(jí)有關(guān)。

Ki-67與細(xì)胞周期密切相關(guān)，能直接反映細(xì)胞增殖情況，與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ki-67在正常腦組織中不表達(dá)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，Ki-67陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)越高，則惡性程度（分級(jí)）越高，預(yù)后越差［13］。本研究結(jié)果顯示Ki-67蛋白表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增高而顯著增高，高級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ki-67表達(dá)與WHO分級(jí)成顯著線性正相關(guān)，提示Ki-67過(guò)表達(dá)可能是膠質(zhì)瘤形成過(guò)程中的晚期事件，隨腫瘤惡性程度升高而表達(dá)增高，反映較差預(yù)后。而本研究顯示Ki-67蛋白低表達(dá)與IDH1基因突變顯著相關(guān)，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道相似，均可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)［15］。

綜上，本研究通過(guò)檢測(cè)膠質(zhì)瘤IDH1、IDH2基因、p53基因突變狀態(tài)，檢測(cè)Ki-67表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在各種類型中，中高級(jí)別（WHOⅡ/Ⅲ級(jí)）膠質(zhì)瘤IDH1基因突變比率最高，提示該類型有特殊性，臨床需要高度關(guān)注，應(yīng)盡量對(duì)該類型進(jìn)行基因檢測(cè)；p53基因突變主要發(fā)生于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中。IDH1基因突變、Ki-67表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤額惡性程度密切相關(guān)，IDH1、p53、Ki-67聯(lián)合檢測(cè)有利于膠質(zhì)瘤的診斷分級(jí)和預(yù)后評(píng)估，具有一定的臨床價(jià)值。IDH1基因突變與Ki-67表達(dá)在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中是否存在內(nèi)在聯(lián)系以及相關(guān)臨床意義，尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］LOUIS D N，PERRY A，REIFENBERGER G，et al.The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system：a summary［J］.Acta Neuropathol，2016，131（6）：803-820.

［2］張偉曉，許小飛，盛丹丹，等.（99m）Tc-MIBI腦腫瘤陽(yáng)性顯像聯(lián)合MRI成像對(duì)膠質(zhì)瘤術(shù)后殘留復(fù)發(fā)的診斷價(jià)值［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（18）：2997-3000.

［3］SKJULSVIK A J，M?RK J N，TORP M O，et al.Ki-67/MIB-1 immunostaining in a cohort of human gliomas［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（12）：8905-8910.

［4］Cancer Genome Atlas Research Network.Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways［J］.Nature，2008，455（7216）：1061-1068.

［5］GRAMATZKI D，KICKINGEREDER P，HENTSCHEL B，et al.Limited role for extended maintenance temozolomide for newly diagnosed glioblastoma［J］.Neurology，2017，88（15）：1422-1430.

［6］PARSONS D W，JONES S，ZHANG X，et al.An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme［J］.Science，2008，321（5897）：1807-1812.

［7］YAN H，PARSONS D W，JIN G，et al.IDH1 and IDH2 mutations in gliomas［J］.N Engl J Med，2009，360（8）：765-773.

［8］WANG H Y，TANG K，LIANG T Y，et al.The comparison of clinical and biological characteristics between IDH1 and IDH2 mutations in gliomas［J］.J Exp Clin Cancer Res，2016，35：86.

［9］BAUMERT B G，HEGI M E，VAN DEN BENT M J，et al.Temozolomide chemotherapy versus radiotherapy in high-risk lowgrade glioma（EORTC 22033-26033）：a randomised，open-label，phase 3 intergroup study［J］.Lancet Oncol，2016，17（11）：1521-1532.

［10］UNRUH D，SCHWARZE S R，KHOURY L，et al.Mutant IDH1 and thrombosis in gliomas［J］.Acta Neuropathol，2016，132（6）：917-930.

［11］TAKAMI H，YOSHIDA A，F(xiàn)UKUSHIMA S，et al.Revisiting TP53 mutations and immunohistochemistry--a comparative study in 157 diffuse gliomas［J］.Brain Pathol，2015，25（3）：256-265.

［12］BRENNAN C W，VERHAAK R G，MCKENNA A，et al.The somatic genomic landscape of glioblastoma［J］.Cell，2013，155（2）：462-477.

［13］BAI Y，LIN Y，ZHANG W，et al.Noninvasive amide proton transfer magnetic resonance imaging in evaluating the grading and cellularity of gliomas［J］.Oncotarget，2017，8（4）：5834-5842.

［14］WANG P F，LIU N，SONG H W，et al.IDH-1R132H mutation status in diffuse glioma patients：implications for classification［J］.Oncotarget，2016，7（21）：31393-31400.

［15］CAHILL D P，SLOAN A E，NAHED B V，et al.The role of neuropathology in the management of patients with diffuse low grade glioma：A systematic review and evidence-based clinical practice guideline［J］.J Neurooncol，2015，125（3）：531-549.