膈下逐瘀湯降低基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子的表達(dá)抑制大鼠肝纖維化形成

張鵬 苗玉榮 曾錦榮 吳正平

1宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院（江西宜春336000）；2暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院（廣州510630）

肝纖維化是肝細(xì)胞經(jīng)炎癥刺激以及發(fā)生壞死時，肝臟中膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的增生與降解失去平衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織發(fā)生異常沉積的病理過程，是慢性肝病的病理基礎(chǔ)，具有可逆性［1］。肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）有關(guān)，對ECM起主要調(diào)節(jié)作用的有基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）［2］，TIMPs主要功能是拮抗MMPs，使ECM保持平衡。因此尋找能夠有效減少TIMP-1表達(dá)，從而降解肝纖維化基質(zhì)，進(jìn)而抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物，并在肝纖維化階段進(jìn)行早期藥物干預(yù)治療，具有重要的臨床意義?，F(xiàn)代祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為：活血化瘀，注重病證結(jié)合，可有效抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［3］。本研究擬通過檢測經(jīng)膈下逐瘀湯治療后肝纖維化SD大鼠的肝功能指標(biāo)、肝纖維化的變化及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP-1）表達(dá)情況，探索膈下逐瘀湯在肝纖維化治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SD大鼠110只，雌雄各半，清潔級，體重（200±20）g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（湘）2014-0015。藥品：膈下逐瘀湯：當(dāng)歸、桃仁（研泥）、紅花、甘草、川芎、丹皮、赤芍、烏藥、靈脂（炒）、香附、枳殼、玄胡索按9：9：9：9：6：6：6：6：6：4.5：4.5：3的比例，水煎制，煎劑于恒溫水浴鍋中濃縮，直至含生藥1.0g/L的湯劑作為原藥，備用。

1.2 試劑和儀器 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）及總膽紅素（T-bil）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）抗體、SP-即用型免疫組化試劑盒、DAB顯色劑和SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；蘇木素為Sigma公司產(chǎn)品；水溶性伊紅為Sigma公司產(chǎn)品；主要儀器BS250S型精密天平（北京賽多利斯天平有限公司）；750型自動生化分析儀（日立公司）。

1.3 肝纖維化模型建立 除正常組外，其余各組大鼠皮下注射純CCl4，劑量5 mL/kg。之后皮下注射含20%CCl4的花生油，劑量3 mL/kg，2次/周，連續(xù)12周。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 第一次110只SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組，第一組（正常對照組，記為A組）：20只大鼠，不作其他處理，常規(guī)飼養(yǎng)12周；第二組（造模組）：90只大鼠，腹腔注射CC140.025 mL（用花生油 1∶6稀釋），每周 2次，共8周，8周末從中隨機(jī)抽取6只大鼠，處死并取得肝組織標(biāo)本，以觀察肝纖維化造模效果。第二次：剩余84只造模組大鼠隨機(jī)分成3組：模型組（B組）、膈下逐瘀湯低劑量組（C組）、膈下逐瘀湯高劑量組（D組），各28只。各組繼續(xù)腹腔注射CC140.025 mL（用花生油 1∶6稀釋），每周2次，共4周。C組與D組分別予以膈下逐瘀湯高劑量（原藥直接使用，生藥含量為1 g/L）和膈下逐瘀湯低劑量（原藥稀釋1倍，生藥含量為0.5 g/L），按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃，1次/d，共4周，而A組和B組給予等容量蒸餾水。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝劑的普通干凈玻璃試管中。剖開大鼠腹腔暴露肝臟，留取肝臟左葉，留取部分肝組織于4%中性福爾馬林液固定，置于包埋盒中，于切片機(jī)切片，厚度3 μm，裱片于普通載玻片上進(jìn)行免疫組化染色。

1.5 血清肝功能指標(biāo)檢測 大鼠末次給藥后禁食24 h，3%戊巴比妥麻醉大鼠，自大鼠腹主動脈取血5～8 mL，離心（3 000 r/min，15 min），取血清放入冰箱（-20℃）保存。按試劑盒說明書中方法操作，檢測ALT、AST、ALB、TP及T-bil五項(xiàng)肝功能生化指標(biāo)。

1.6 肝纖維化評分 各組大鼠肝組織行常規(guī)HE染色，根據(jù)《肝纖維化分期半定量評估系統(tǒng)Ishak》進(jìn)行評分［4］。選取10個高倍視野進(jìn)行觀察，并評定。評分方法：0分：完全無纖維化；1分：匯管區(qū)周圍部分細(xì)胞壞死，纖維隔可見，呈輕度纖維化；2分：30%匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化，且形成纖維隔；3分：70%匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化，偶見匯管區(qū)橋接纖維化；4分：90%匯管區(qū)呈纖維化，伴匯管-匯管橋接纖維化及匯管-中央橋接纖維化。

1.7 肝臟組織TIMP-1檢測 采用SP法檢測TIMP-1在大鼠肝組織中的陽性表達(dá)：TIMP-1抗體稀釋度為1∶200；參照免疫組化顯色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷：根據(jù)染色范圍及程度評定免疫組化結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 14.0軟件，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對血清肝功能的影響

2.1.1 實(shí)驗(yàn)大致情況 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，110只SD大鼠中有7只死亡（非人為處死），分別為模型組4只、膈下逐瘀湯低劑量組2只和膈下逐瘀湯高劑量組1只，死亡率為6.4%。

2.1.2 血清肝功能指標(biāo)比較 正常組大鼠血清ALT含量為（29.15±3.64）U/L，低劑量組血清ALT（56.84±7.12）U/L與高劑量組大鼠血清ALT（49.25±5.47）U/L較模型組血清 ALT（64.27±8.57）U/L組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；正常組、低劑量組與高劑量組大鼠血清AST、T-Bil較模型組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠血清中TP、ALB分別為（63.42± 7.58）g/L、（34.29± 4.26）g/L，正常組、低劑量組與高劑量較模型組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；見表1。

2.2 肝維化Ishak評分 在Ishak評分為0分方面，與正常組大鼠比例為100%相比，其余各組所占比例為0，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；在Ishak評分為1分方面，與模型組大鼠比例為12.5%相比，低、高劑量組所占比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；在Ishak評分為2分方面，與模型組大鼠比例為12.5%相比，低、高劑量組所占比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在Ishak評分為3分方面，與模型組大鼠比例為33.3%相比，低、高劑量組所占比例降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在Ishak評分為4分方面，與模型組比例為41.7%相比，低、高劑量組所占比例明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠肝臟組織病理特點(diǎn) 肉眼觀察大鼠肝臟大體標(biāo)本，正常組：表面淡紅色，切面實(shí)性，淡紅色；模型組：肝臟表面灰白色，切面呈明顯結(jié)節(jié)狀，結(jié)節(jié)間可見灰白色纖維樣物；低劑量組：膈下逐瘀湯肝臟表面均為淡紅色，切面呈不明顯的結(jié)節(jié)狀，淡紅色；高劑量組：與低劑量組相似，肉眼無明顯差異。見圖1。

表1 各組肝纖維化大鼠血清肝功能指標(biāo)水平Tab.1 Each group of liver fibrosis rat serum liver function index level ±s

表1 各組肝纖維化大鼠血清肝功能指標(biāo)水平Tab.1 Each group of liver fibrosis rat serum liver function index level ±s

注：與模型組比較，#P＜0.01，*P＜0.05

組別正常組模型組低劑量組高劑量組n 20 24 26 27--3.0 6.0 ALT（U/L）29.15±3.64#64.27±8.57 56.84±7.12#49.25±5.47#AST（U/L）43.81±4.59*78.65±9.72 71.35±9.06*66.27±8.15*T-bil（μmol/L）16.27±2.15*20.25±2.68 18.59±2.45*17.62±2.38*TP（g/L）74.26±8.92*63.42±7.58 67.52±7.83*70.15±8.36*ALB（g/L）41.38±5.29*34.29±4.26 36.51±4.72*39.28±5.04*

表2 各組肝纖維化大鼠Ishak評分Tab.2 Ishak scores of liver fibrosis rats in each group例

圖1 各組大鼠肝臟纖維化情況及TIMP-1表達(dá)情況Fig.1 Hepatic fibrosis and expression of TIMP-1 in rats in each group

HE染色正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)周圍可見少量膠原纖維增生。模型組：肝小葉內(nèi)大量纖維組織增生，可見大量匯管-匯管橋接纖維化和匯管-中央橋接纖維化區(qū)，呈相互交結(jié)狀，形成不完全或完全性假小葉，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝血竇擴(kuò)張，胞漿疏松化，纖維間隔可見大量淋巴、單核細(xì)胞浸潤。與模型組比較，膈下逐瘀湯組肝小葉結(jié)構(gòu)修復(fù)現(xiàn)象明顯，Kupffer細(xì)胞明顯增生，有較多膠原纖維生成，但未形成完全假小葉，變性肝細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤顯著減輕，纖維化增生程度減輕，而高劑量組纖維化增生程度明顯減輕。見圖1。

2.4 對肝臟組織TIMP-1表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常組大鼠肝組織中TIMP-1幾無表達(dá)；模型組陽性染色范圍廣，匯管區(qū)、纖維間隔內(nèi)和肝竇處的間質(zhì)細(xì)胞胞漿均可見到，膈下逐瘀湯低劑量組陽性染色程度較模型組減輕，高劑量組染色程度明顯減輕見圖1。

3 討論

肝纖維化是一種常見的嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，是機(jī)體對慢性肝損傷炎癥刺激的一種修復(fù)反應(yīng)，也是肝硬化發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)。目前治療肝硬化真正有效的西藥很少，因此尋找能干預(yù)肝纖維化、改善肝病進(jìn)展的中藥，可成為新的研究方向。清代醫(yī)家王清任認(rèn)為膈下逐瘀湯可通過活血行氣，從而達(dá)到逐瘀的目的［3］。從現(xiàn)代研究來看，逐瘀也可改善肝臟血液循環(huán)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，縮小腫大的脾臟，對防治肝纖維化有一定作用［5］。

肝纖維化形成涉及復(fù)雜的細(xì)胞、分子機(jī)制，其本質(zhì)是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的大量沉積，而ECM的代謝主要受MMPs及其抑制因子TIMPs調(diào)節(jié)［6］。TIMPs主要功能是與MMPs相互拮抗作用，使ECM處于穩(wěn)態(tài)，是重要的酶家族之一，目前已發(fā)現(xiàn)4種，即TIMP-1到TIMP-4。TIMP-1在正常肝組織中表達(dá)很少，而在纖維化過程中，由于被激活的肝臟星狀細(xì)胞（HSC）大量分泌TIMP-1，使其含量進(jìn)行性升高，而后與MMP-1特異性結(jié)合，抑制MMP-1活性，降低ECM的降解，使ECM在肝組織間隙沉積，促進(jìn)肝臟纖維化進(jìn)程［7］。

在肝纖維化中，ECM合成增多和降解減少的全過程，MMPs減少，而TIMPs則增加［8］。研究表明中藥絞股藍(lán)總皂苷［9］對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠TIMP-1及MMP-1起著積極影響。用絞股藍(lán)總皂苷治療肝纖維化的小鼠動物模型中小鼠體內(nèi)TIMP-1的表達(dá)下降而MMP-1逐漸增加，從而減輕肝纖維化程度。復(fù)方丹參滴丸［10］、肝復(fù)康［11］、銀杏葉提取物［12］等中醫(yī)藥也有類似的作用。因此對肝組織纖維化的治療也將成為祖國中醫(yī)藥的應(yīng)用熱點(diǎn)之一。

本研究通過檢測經(jīng)膈下逐瘀湯治療后的各組肝纖維化大鼠肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALB、TP及T-bil）、肝纖維化Ishak評分及TIMP-1表達(dá)的變化，結(jié)果顯示：正常組、低劑量組及高劑量組血清ALT、AST、T-Bil含量較模型組降低，其中高劑量組的血清ALT、AST、T-Bil含量最低，而低劑量組次之，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1），這說明經(jīng)膈下逐瘀湯治療的大鼠，其肝功能損傷程度減輕；正常組、低劑量組與高劑量組血清TP、ALB較模型組升高，其中高劑量組血清TP、ALB含量最高，而低劑量組次之，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1），這說明經(jīng)膈下逐瘀湯治療的大鼠，其肝功能合成能力增強(qiáng)，有助于肝臟的修復(fù)。在Ishak評分為0分方面，正常組大鼠比例為100%，其余各組所占比例為0，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功；在Ishak評分為1分、2分方面，與模型組大鼠相比，低、高劑量組所占比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在Ishak評分為3分、4分方面，與模型組大鼠相比，低、高劑量組所占比例明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)膈下逐瘀湯治療的大鼠，肝纖維程度明顯減輕。從肝纖維化大鼠肝功能指標(biāo)、肝纖維化Ishak評分方面，可知膈下逐瘀湯可以改善肝功能、增強(qiáng)肝臟的修復(fù)功能及降低肝纖維化程度。從肝臟組織TIMP-1表達(dá)上看，正常組大鼠肝組織中TIMP-1幾無表達(dá)，模型組TIMP-1明顯表達(dá)，膈下逐瘀湯低劑量組及高劑量組陽性染色程度較模型組減輕（圖1）。這提示肝纖維化與TIMP-1上調(diào)有關(guān)，與文獻(xiàn)報道一致［7］。肝纖維化是各種病因引起慢性肝實(shí)質(zhì)損傷后的瘢痕修復(fù)反應(yīng)［13］，黃大健等［14］研究發(fā)現(xiàn)大劑量荔枝核總黃酮可減輕膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝損傷及有效改善肝纖維化程度，其作用機(jī)制是通過抑制生長因子-β1（TGF-β1）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）高表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的分泌，從而緩解肝臟的纖維化。而本研究發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯可能通過抑制TIMP-1分泌，減少ECM的分泌，從而抑制肝臟纖維化。膈下逐瘀湯抑制TIMP-1分泌，與通過阻止TGF-β/Smad信號通路［14-15］的啟動作用機(jī)制不同，而這兩種機(jī)制最終都可以達(dá)到減少ECM的分泌，從而抑制肝臟纖維化，這證明肝纖維化的過程受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文以SD肝纖維化大鼠為研究對象，結(jié)果顯示膈下逐瘀湯具有抑制TIMP-1表達(dá)，從而起到抗肝纖維化作用，初步探索了膈下逐瘀湯對肝纖維化的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明膈下逐瘀湯在預(yù)防和治療肝纖維化中具有積極作用，同時也為膈下逐瘀湯成為治療肝纖維化新方法提供理論基礎(chǔ)，為我們在臨床上尋找到更安全、廉價、高效的治療肝纖維化中醫(yī)藥物提供了依據(jù)。

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