克拉霉素微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

胡小鋒

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700

克拉霉素在臨床上主要用于抗感染治療，屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)部分革蘭陰性菌，革蘭陽(yáng)性菌及支原體的感染有很強(qiáng)的治療作用。在2015年版《中國(guó)藥典》中記載，1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。本文采用五種陽(yáng)性對(duì)照菌，對(duì)其回收率進(jìn)行測(cè)定，用微生物限度檢查方法學(xué)對(duì)克拉霉素進(jìn)行試驗(yàn)[1]。

1 試驗(yàn)材料和儀器

（1）供 試 樣 品：克 拉 霉 素，批 號(hào)：Y00601170401G、Y00601170402G、Y00601170403G，廠家：寧夏啟元藥業(yè)有限公司。

（2）培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)：20151012，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)：20150215，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號(hào)：VM679659509，廠家：默克密理博；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號(hào)：20150215，廠家：青島日水生物技術(shù)有限公司；pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，批號(hào)：VM680982514，廠家：默克密理博；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液：批號(hào)：1609281601，廠家：石家莊四藥有限公司。

（3）試驗(yàn)菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

（4）儀器：鑫貝西生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X；永生生化培養(yǎng)箱SHH-500L。

2 計(jì)數(shù)需氧菌、霉菌及酵母菌的驗(yàn)證方法

克拉霉素為抗生素類藥物，具有較強(qiáng)的抑菌活性，在2015年版《中國(guó)藥典》中記載，隨非無(wú)菌產(chǎn)品1105進(jìn)行微生物限度測(cè)試，本品采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1 菌液制備

將銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物倒入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)18-24h；把白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)2-3d。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成的菌懸液可以得到上述培養(yǎng)物。用沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物[2]，經(jīng)23℃培養(yǎng)5-7d，加入3-5mL的含0.05%（mL/mL）的聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫，然后用無(wú)菌試管吸出孢子懸液，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。各試驗(yàn)菌的接種量不大于100cfu。

2.2 供試液的制備

取10g試驗(yàn)樣品，加入pH7.0的蛋白胨氯化鈉緩沖液至100ml，制成10-1供試液。取10-1供試液10ml，加入pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液至100ml，制成10-2供試液，取10-1供試液10ml，加入pH7.0白胨緩氯化鈉緩沖液至100ml，制成10-3供試液。

2.3 薄膜過(guò)濾法（常規(guī)方法）

（1）試驗(yàn)組：取10ml供試品10-2，分別加入各試驗(yàn)菌（不超過(guò)100cfu）混勻，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml。

（2）菌液組：以稀釋劑代替供試液，加入各試驗(yàn)菌進(jìn)行試驗(yàn)組操作。

（3）供試品組：取10-2供試品10ml，用稀釋劑代替菌液進(jìn)行試驗(yàn)組操作。

（4）試驗(yàn)菌回收率的計(jì)算：回收率=[（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)]×100%。

（5）結(jié)果判斷：試驗(yàn)菌回收率均在50%以上，這與驗(yàn)證測(cè)試相對(duì)應(yīng)，可按照此方法進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌的微生物計(jì)數(shù)，若試驗(yàn)菌回收率低于50%，應(yīng)排除供試品的抑菌性，并重新找方法進(jìn)行試驗(yàn)。

（6）克拉霉素通過(guò)薄膜過(guò)濾法，需氧菌總數(shù)檢查試驗(yàn)菌回收率結(jié)果，見(jiàn)表1；霉菌和酵母菌總數(shù)檢查試驗(yàn)菌回收率結(jié)果，見(jiàn)表2。

表1 需氧菌總數(shù)檢查方法試驗(yàn)菌回收率（薄膜過(guò)濾法）

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法試驗(yàn)菌回收率（薄膜過(guò)濾法）

由表2所示，白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率50%以上，此方法適用于霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，但是由表1可以看出，雖然白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率50%以上，而金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的回收率為0%。由此可見(jiàn)，克拉霉素對(duì)細(xì)菌的抑制性很強(qiáng)，排除供試品的抑菌活性必須重新找方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 薄膜過(guò)濾法（采用高稀釋級(jí)別供試液并采用不同沖洗量）

（1）試驗(yàn)組：取10ml供試品10-3，加入試驗(yàn)菌（不超過(guò)100cfu）混勻，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，采用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，每次用量為100ml，總沖洗量分別是300ml、500ml、800ml。

（2）菌液組、供試品對(duì)照組均同法操作。

（3）克拉霉素薄膜過(guò)濾法（采用高稀釋級(jí)別供試液并采用不同沖洗量），細(xì)菌試驗(yàn)菌回收率結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 細(xì)菌試驗(yàn)菌回收率（采用高稀釋級(jí)別供試液并采用不同沖洗量）

由表3所示，采用最高的稀釋級(jí)別10-3供試液10ml進(jìn)行薄膜過(guò)濾，沖洗量為300ml，銅綠假單胞菌的回收率在50%以上；而總沖洗量為800ml時(shí)，金黃色葡萄球菌回收率僅為20.6%，枯草芽孢桿菌的回收率為40.5%，仍低于50%，需要重新建立方法進(jìn)行驗(yàn)證。由此可見(jiàn)，克拉霉素對(duì)細(xì)菌抑菌作用強(qiáng)，特別是對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用。

2.5 薄膜過(guò)濾法（采用均質(zhì)袋）

（1）供試液的制備：取供試品10g，加入pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液100ml，并置含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，并使其均勻分散，制成10-1供試液。取10-1供試液10ml，加入pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液100ml，制成10-2供試液。依上述方法制成10-3供試液。

（2）試驗(yàn)組：取10-3供試品10ml，加入500mlpH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液，再分別加入試驗(yàn)菌（不超過(guò)100cfu）混勻，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml。

（3）菌液組、供試品對(duì)照組均同法操作。

（4）克拉霉素通過(guò)薄膜過(guò)濾法（采用均質(zhì)袋），需氧菌總數(shù)檢查方法試驗(yàn)菌回收率結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 需氧菌總數(shù)檢查方法試驗(yàn)菌回收率（薄膜過(guò)濾法采用均質(zhì)袋）

由表4所示，采用均質(zhì)袋，利用薄膜過(guò)濾法，進(jìn)行試驗(yàn)后各菌的回收率都在50%以上，證明這種方法可以排除供試品的抑菌性，因此可采用均質(zhì)袋并通過(guò)薄膜過(guò)濾法進(jìn)行克拉霉素的需氧菌計(jì)數(shù)。

3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

（1）供試液的制備：取10g供試品，加入pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液100ml，并置含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，使分散均勻，制成10-1供試液。

（2）試驗(yàn)組：取10ml供試品10-1，加入500mlpH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液，再加入大腸埃希菌（不超過(guò)100cfu）混勻，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml，抽濾，取濾膜至400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,33℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，依法檢查。

（2）陽(yáng)性對(duì)照組：取不超過(guò)100cfu大腸埃希菌至400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。

（3）陰性對(duì)照組：以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)的控制菌檢查法檢查。

（4）試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。

4 結(jié)果

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，克拉霉素的微生物限度檢查采用下列方法，取10g供試品，加入pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液到100ml，并置含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，使分散均勻，制成10-1供試液，依次制成10-2、10-3供試液，需氧菌總數(shù)：取10ml供試品10-3，加入500mlpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml；霉菌和酵母菌總數(shù)：取10ml供試品10-2，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml；控制菌檢查：取10ml供試品10-1，加入500mlpH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次沖洗量為100ml，取濾膜至400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依法檢查大腸埃希菌。

5 討論

有很多因素直接影響微生物的生長(zhǎng)，特別是對(duì)藥品微生物的污染。一些藥物自身具有抑菌作用，因此利用微生物限度檢查方法對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮采用適合的方法排除對(duì)供試品的抑菌性。克拉霉素對(duì)細(xì)菌的抑菌作用很強(qiáng)，本文試驗(yàn)供試品制備時(shí)，采用含濾網(wǎng)的均質(zhì)袋，使藥品分散均勻，吸取供試液加入到稀釋劑中，再進(jìn)行薄膜過(guò)濾，并沖洗，聯(lián)合作用下去除了克拉霉素的抑菌活性，提高了克拉霉素微生物污染菌的檢出。