黃芪多糖抑制糖尿病心肌氧化應(yīng)激的初步研究

陳蔚　鞠婧　王浩

[摘要] 目的 探討黃芪多糖對糖尿病心肌氧化應(yīng)激的影響。 方法 將16只6～8周齡的雄性健康轉(zhuǎn)基因SOD2+/-KO小鼠（C57BL/6J背景）按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為轉(zhuǎn)基因組及黃芪多糖轉(zhuǎn)基因組（n = 8）；將24只正常對照小鼠分為對照組、糖尿病組及黃芪多糖糖尿病組（n = 8）。糖尿病組和黃芪多糖糖尿病組采用鏈脲佐菌素腹腔注射法制作糖尿病動物模型，糖尿病模型建成功后，給予黃芪多糖糖尿病組和黃芪多糖轉(zhuǎn)基因組小鼠黃芪多糖注射液治療16周，其余組則給予等量生理鹽水灌胃。采用超聲心動圖檢測心臟功能，HE染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)，超聲電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，免疫組化法檢測心肌細(xì)胞增殖活性，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，熒光定量法檢測心肌活性氧（ROS）含量，Western blot法檢測心肌SOD2蛋白含量，SODⅡ試劑盒檢測心肌SOD2酶活性。 結(jié)果 與對照組比較，糖尿病組和轉(zhuǎn)基因組LVSP、±LVdp/dt下降，LVEDP升高，心肌組織和超微結(jié)構(gòu)存在嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞凋亡和壞死程度增加，SOD2活性被顯著抑制，而黃芪多糖治療組小鼠以上指標(biāo)均得到改善（P < 0.05）。 結(jié)論 黃芪多糖能抑制糖尿病心肌的氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞] 黃芪多糖；糖尿??；心肌??；氧化應(yīng)激；SOD2

[中圖分類號] R5871.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Astragalus polysaccharides for myocardial oxidative stress of diabetes mellitus. Methods Sixteen male healthy transgenic SOD2+/-KO mice aged 6-8 weeks old （C57BL/6J） were randomly divided into transgenic group and Astragalus polysaccharides transgenic group by random number table method （n = 8）. The 24 normal control mice were divided into control group， diabetes mellitus group and Astragalus polysaccharides diabetes mellitus group （n = 8）. Single intraperitoneal injection of Streptozotocin was utilized to establish mice model with diabetes mellitus in diabetes mellitus group and Astragalus polysaccharides diabetes mellitus group， after the diabetes mellitus model was made successfully， the mice in Astragalus polysaccharides diabetes mellitus group and Astragalus polysaccharides transgenic group were treated with Astragalus Polysaccharides Injection for 16 weeks， and the other groups were given equal amount of normal saline. Echocardiography was used to detect cardiac function， HE staining was used to observe the structure of myocardial tissue， ultrasonic electron microscopy was used to observe the myocardial ultrastructure， immunohistochemistry was used to detect the proliferative activity of cardiomyocytes， TUNEL method was used to detect apoptosis of cardiomyocytes； fluorescent quantitative assay was used to detect the contents of myocardial reactive oxygen species （ROS）， Western blot was used to detect the contents of myocardial SOD2 protein， calbiochem SOD assay kit Ⅱ was used to detect the activity of myocardial SOD2. Results Compared with the control group， LVSP and ±LVdp/dt in diabetes mellitus group and transgenic group were decreased， and LVEDP was increased， myocardial tissue and ultrastructure were seriously damaged， the degree of cells apoptosis and necrosis was increased， and the activity of SOD2 was significantly inhibited. However， the indices above in the Astragalus polysaccharides were all signifcantly improved （P < 0.05）. Conclusion Astragalus polysaccharides can inhibit the myocardial oxidative stress injury of diabetes mellitus.

[Key words] Astragalus polysaccharide； Diabetes； Cardiomyopathy； Oxidative stress； SOD2

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是一種獨(dú)立于高血壓和動脈粥樣硬化之外的特異性心肌病變，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)[1-3]，氧化還原失平衡是DCM的主要發(fā)病機(jī)制之一[4-7]。過氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）是體內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激活酶之一，其中SOD2是抑制心肌線粒體生成活性氧（ROS）的主要抗氧化應(yīng)激活酶。研究表明[8-13]，糖尿病鼠心肌細(xì)胞的過度凋亡、氧化還原失衡與心肌內(nèi)SOD2表達(dá)降低顯著相關(guān)，調(diào)控SOD2表達(dá)是阻斷糖尿病心肌氧化還原失衡的一個重要靶點(diǎn)。黃芪是一味傳統(tǒng)中藥，黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是其主要活性成分之一。本研究采用黃芪多糖對DCM和SOD2+/-小鼠模型進(jìn)行治療，探討其抑制DCM氧化應(yīng)激損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和藥物

6～8周齡的雄性SOD2+/-KO小鼠和正常對照小鼠，購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。APS購自上海中科院生理所。

1.2 動物分組及給藥

按照隨機(jī)數(shù)字表法將16只6～8周齡的雄性健康SOD2+/-KO小鼠隨機(jī)分為轉(zhuǎn)基因組及黃芪多糖轉(zhuǎn)基因組（n = 8），將24只正常對照小鼠分為對照組、糖尿病組及黃芪多糖糖尿病組（n = 8）。以上小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，飼養(yǎng)條件為恒溫（23±2）℃，相對濕度（50±5）%，每日光照12 h，飼養(yǎng)期間所有小鼠自由攝食、飲水。糖尿病組和黃芪多糖糖尿病組給予鏈脲佐菌素（100 mg/kg）單次腹腔注射，其余組采用相同劑量的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。糖尿病動物模型建立成功后，給予黃芪多糖糖尿病組和黃芪多糖轉(zhuǎn)基因組小鼠APS注射液[2000 mg/（kg·d）]胃管給藥治療16周，其余組給予等量生理鹽水灌胃。治療期間監(jiān)測小鼠血糖、體重、血壓和心率，治療完成后處死小鼠，留取血、心臟組織。

1.3 心臟功能及血液動力學(xué)參數(shù)檢測

1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，采用Vevo 2100型小動物彩色超聲診斷儀，采集小鼠心臟超聲圖像。

1.4 心臟組織病理、超微結(jié)構(gòu)觀察

將一部分心肌組織制成石蠟空白片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察病理組織；另一部分制成半薄切片，電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡和增殖檢測

使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒對石蠟切片進(jìn)行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

1.6 心肌ROS含量和SOD2酶活性檢測

DHE/ET熒光定量法檢測ROS含量，SODⅡ試劑盒（Calbiochem SOD Assay Kit Ⅱ）檢測SOD活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重及血糖、糖化血紅蛋白水平

與對照組比較，轉(zhuǎn)基因組和黃芪多糖轉(zhuǎn)基因組體重、血糖和糖化血紅蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與對照組比較，糖尿病組小鼠8、24周血糖和24周糖化血紅蛋白水平明顯升高，24周體重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與糖尿病組比較，黃芪多糖糖尿病組8、24周血糖、24周糖化血紅蛋白水平明顯降低，24周體重明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 心臟功能和血液動力學(xué)

與對照組比較，糖尿病組和轉(zhuǎn)基因組小鼠的心臟重量和心臟/體重比值均明顯下降（P < 0.05），而黃芪多糖治療后，小鼠心重、心臟/體重比值均明顯升高（P < 0.05）。與對照組比較，糖尿病組和轉(zhuǎn)基因組小鼠血液動力學(xué)明顯紊亂，其中LVEDP明顯升高，LVSP、LVFS和±LVdp/dt明顯下降（P < 0.05），而黃芪多糖治療后，LVEDP明顯下降，LVSP、LVFS和±LVdp/dt明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2、圖1（封三）。

2.3 心肌病理組織及心肌超微結(jié)構(gòu)

與對照組比較，糖尿病組和轉(zhuǎn)基因組心肌細(xì)胞形態(tài)異常、排列和結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體破壞、心肌纖維紊亂、間質(zhì)膠原纖維異常增生，富含糖原顆粒、脂滴；黃芪多糖治療后心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列和結(jié)構(gòu)整齊，線粒體完整、心肌纖維排列規(guī)則、間質(zhì)膠原纖維減少。見圖2（封三）。

2.4 心肌細(xì)胞凋亡和壞死

與對照組比較，糖尿病組和轉(zhuǎn)基因組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡和壞死程度增高（P < 0.05）；黃芪多糖治療明顯抑制了心肌細(xì)胞的凋亡和壞死（P < 0.05）。見圖3。

2.5 ROS產(chǎn)量和SOD2酶活性

與對照組比較，糖尿病組和轉(zhuǎn)基因組小鼠的心肌細(xì)胞中ROS顯著升高（P < 0.05），SOD2酶活性明顯下降（P < 0.05）；黃芪多糖治療抑制ROS生成并上調(diào)黃SOD2酶活性（P < 0.05）。見圖4（封三）。

3 討論

糖尿病是影響人類健康的三大主要慢性病之一，目前我國成人糖尿病的患病率已經(jīng)達(dá)到11.6%[1-2]。DCM是一種獨(dú)立于高血壓、動脈粥樣硬化之外的特異性心肌病變，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)[3]。然而，目前國內(nèi)外尚無特效藥可以用于治療DCM。因此，尋找安全有效的藥物治療以阻斷或延緩DCM的發(fā)生、發(fā)展具有重要的意義。

大量研究已證實(shí)氧化應(yīng)激是DCM的主要發(fā)病機(jī)制之一[4-7]。SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激活酶之一，可以催化超氧化物自由基[O2-]產(chǎn)生過氧化氫[H2O2]，最后降解為H2O。SOD2是抑制心肌線粒體生成活性氧化物質(zhì)的主要抗氧化應(yīng)激活酶[8-10]。研究表明糖尿病鼠心肌的過度凋亡、氧化應(yīng)激損傷與心肌內(nèi)SOD2表達(dá)降低顯著相關(guān)，而給予糖尿病鼠SOD2類似物干預(yù)治療后或利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在其體內(nèi)過表達(dá)SOD2基因后，糖尿病鼠心肌的過度凋亡和氧化應(yīng)激損傷減少，糖尿病心肌的病理和功能顯著改善[8]，提示調(diào)控SOD2是抑制糖尿病心肌多潛能干細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的一個重要靶點(diǎn)[8-12]。

黃芪是一味傳統(tǒng)中藥，黃芪多糖是其均一多糖部分，為黃芪主要活性成分之一。本課題組的前期研究已驗(yàn)證[13-16]，應(yīng)用黃芪多糖治療糖尿病對DCM有明確的保護(hù)作用，可以顯著糾正各類糖尿病模型鼠的心臟功能障礙、血液動力學(xué)異常，改善DCM理和超微結(jié)構(gòu)的異常，下調(diào)糖尿病心肌心衰因子的基因表達(dá)和蛋白含量。

本研究結(jié)果顯示，黃芪多糖治療可以糾正轉(zhuǎn)基因SOD2+/-KO小鼠、糖尿病小鼠的心臟功能障礙和血液動力學(xué)紊亂，改善SOD2+/-KO小鼠、糖尿病小鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)異常和超微結(jié)構(gòu)異常，提示黃芪多糖可以保護(hù)糖尿病心肌和氧化應(yīng)激心肌的組織結(jié)構(gòu)和心臟功能。黃芪多糖治療抑制轉(zhuǎn)基因SOD2+/-KO小鼠、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的心肌細(xì)胞的凋亡和壞死程度，提示黃芪多糖可以抑制糖尿病心肌和氧化應(yīng)激心肌的細(xì)胞凋亡和壞死，阻止氧化應(yīng)激引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡和壞死。黃芪多糖治療后，轉(zhuǎn)基因SOD2+/-KO小鼠、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌細(xì)胞的ROS含量下降，心肌SOD2酶活性明顯提高，提示黃芪多糖可以抑制糖尿病心肌和氧化應(yīng)激心肌的ROS生成，可能與其對心肌SOD2酶活性的調(diào)控作用相關(guān)。

綜上所述，黃芪多糖通過調(diào)控SOD2表達(dá)能抑制糖尿病心肌氧化應(yīng)激損傷，從而恢復(fù)心肌凋亡增殖體系平衡，阻止DCM的發(fā)生與發(fā)展。黃芪多糖對心肌SOD2的調(diào)控表達(dá)機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al. Prevalence of diabetes amongmen and women in China [J]. N Engl J Med，2010，362（12）：1090-1101.

[2] Mandavia H，Aroor AR，DeMarco VG，et al. Molecular and metabolic mechanisms of cardiac dysfunction in diabetes [J]. Life Sci，2013，92（11）：601-608.

[3] Goyal BR，Mehta AA. Diabetic cardiomyopathy：Pathophysiological mechanisms and cardiac dysfuntion [J]. Hum Exp Toxicol，2013，32（6）：571-590.

[4] Marchi ED，Baldassari F，Bononi A，et al. Oxidative stress in cardiovascular diseases and obesity：role of p66shc and protein kinase C [J]. Oxid Med Cell Longev，2013，2013：564961.

[5] Giacco F，Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications [J]. Circ Res，2010，107（9）：1058-1070.

[6] Watanabe K，Thandavarayan RA，Harima M，et al. Role of differential signaling pathways and oxidative stress in diabetic cardiomyopathy [J]. Curr Cardiol Rev，2010，6（4）：280-290.

[7] Mandavia CH，Aroor AR，DeMarco VG，et al. Molecular and metabolic mechanisms of cardiac dysfunction in diabetes [J]. Life Sci，2013，92（11）：601-608.

[8] Liang LP，Waldbaum S，Rowley S，et al. Mitochondrial oxidative stress and epilepsy in SOD2 deficient mice：attenuation by a lipophilic metalloporphyrin [J]. Neurobiol Dis，2012，45（3）：1068-1076.

[9] Liu C，Ogando D，Bonanno J. SOD2 contributes to anti-oxidative capacity in rabbit corneal endothelial cells [J]. Mol Vis，2011，17：2473-2481.

[10] Ramachandran A，Lebofsky M，Weinman S，et al. The impact of partial manganese superoxide dismutase（SOD2）-deficiency on mitochondrial oxidant stress，DNA fragmentation and liver injury during acetaminophen hepatoxicity [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2011，251（3）：226-233.

[11] Ascencio-Montiel Ide J，Parra EJ，Valladares-Salgado A，et al. SOD2 gene Val16Ala polymorphism is associated with macroalbuminuria in Mexican type 2 diabetes patients：a comparative study and meta-analysis [J]. BMC Med Genet，2013，14：110-121.

[12] Du K，Yu Y，Zhang D，et al. NFκB1（p50）suppresses SOD2 expression by inhibiting FoxO3a transactivation in a miR190/PHLPP1/Akt-dependent axis [J]. Mol Biol Cell，2013，24（22）：3577-3583.

[13] Chen W，Li YM，Yu MH. Astragalus Polysaccharides：An Effective Treatment for Diabetes Prevention in NOD Mice [J]. Exp Clin Endocr Diab，2008，116（8）：468-474.

[14] Chen W，Li YM，Yu MH. Astragalus polysaccharides inhibited diabetic cardiomyopath in hamsters depending on supression of heart chymase activation [J]. J Diabetes Complicat，2010，24（3）：199-208.

[15] Chen W，Xia YP，Chen WJ，et al. Improvement of myocardial glycolipid metabolic disorder in diabetic hamster with Astragalus polysaccharides treatment [J]. Mol Biol Rep，2012，39（7）：7609-7615.

[16] Chen W，Chen WJ，Xia YP，et al. Therapy with Astragalus polysaccharides rescues lipotoxic cardiomyopathy in MHC-PPARa mice [J]. Mol Biol Rep，2013，40（3）：2449-2459.

（收稿日期：2017-09-04 本文編輯：張瑜杰）