烏司他丁預(yù)處理對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠神經(jīng)保護作用的初步研究

史濤　顧志成　姜廣宇

【摘要】 目的：探討烏司他?。║TI）預(yù)處理對SD大鼠顱腦損傷早期的神經(jīng)保護作用及其機制。方法：選取雄性SD大鼠48只，隨機分為假手術(shù)組（SO組）、烏司他丁預(yù)處理組（UTI組）、生理鹽水對照組（Control組）和創(chuàng)傷性腦損傷組（TBI組）。分別給予UTI組和Control組連續(xù)3 d UTI 300 000 U/（kg·d）及等體積生理鹽水腹腔注射。除SO組外，其余各組采用自由落體打擊法建立創(chuàng)傷性腦損傷模型。打擊后，采用改良的神經(jīng)功能缺損評分評估四組大鼠的神經(jīng)功能，干濕重法檢測腦組織含水量，連續(xù)切片行HE染色后計算腦損傷的體積，經(jīng)尾靜脈采血用ELISA法檢測血清S100B蛋白及NSE濃度變化。結(jié)果：UTI組顱腦損傷早期神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量及腦組織損傷體積均小于Control組（P<0.05），同時UTI組的血清S100B蛋白及NSE濃度均低于Control組（P<0.05），且UTI組、Control組及TBI組三組的血清S100B蛋白及NSE濃度均呈雙峰變化。結(jié)論：烏司他丁預(yù)處理可降低實驗大鼠顱腦損傷早期血清S100B蛋白及NSE濃度，減輕腦水腫及腦組織損傷體積，改善神經(jīng)功能缺損，具有神經(jīng)保護作用。

【關(guān)鍵詞】 烏司他??； 創(chuàng)傷性腦損傷； S100B； NSE

Protective Effect of Ulinastatin Pretreatment on Traumatic Brain Injury Rat Model/SHI Tao，GU Zhicheng，JIANG Guangyu，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：040-045

【Abstract】 Objective：To investigate the protective mechanism of Ulinastatin on traumatic brain injury rat model.Method：Forty-eight SD rats were randomly divided into four groups：sham operation group（SO group），NaCl control group（Control group），UTI pretreatment group（UTI group），and traumatic brain injury group（TBI group）.UTI group and Control group were given UTI 300 000 U/（kg·d） and the same volume of saline by intraperitoneal injection respectively.A closed TBI model was established by weight-drop device in the other groups except for SO group.The modified criteria of neurological defecting score was adopted to evaluate the nerve function of four groups.The wet-dry weighing method was used to detect the brain water content.The volume of brain injury was calculated after HE staining with serial section.The serum S100B protein and NSE from tail vein were detected by ELISA.Result：Compared with Control group，the score of neurological impairment，the water content，the volume of brain tissue defecting of UTI group were less（P<0.05）.The serum S100B protein and NSE concentration of UTI group were lower than those of Control group（P<0.05）.In addition，the serum S100B protein and NSE concentration in UTI group，Control group and TBI group showed a double peak change.Conclusion：Ulinastatin pretreatment will decrease the serum S100B protein and NSE concentration of the rats with traumatic brain injury in early stage，reduce cerebral edema，decrease the volume of brain tissue injury，improve nerve function defect and has a nerve protective effect.

【Key words】 Ulinastatin； Traumatic brain injury； S100B； NSE

First-authors address：Graduate Department，Medical College of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.010

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）作為一種嚴重危及人體健康的疾病，發(fā)生率占全身各部位損傷的20%左右，盡管目前對其的救治水平已顯著提高，但因傷及了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其仍然是創(chuàng)傷死亡原因的第一位[1]。另外，顱腦手術(shù)作為一種可預(yù)見的損傷方式，正在各大醫(yī)院普遍發(fā)生，能否通過術(shù)前給藥增加腦組織對損傷的耐受性或減輕腦細胞的炎癥反應(yīng)、壞死及凋亡等一系列病理生理反應(yīng)仍然值得廣大醫(yī)務(wù)工作者深入研究。

近年來國內(nèi)外的研究顯示，烏司他?。║linastatin，UTI）作為一種廣譜蛋白酶抑制劑，具有穩(wěn)定細胞膜、溶酶體膜及免疫調(diào)節(jié)作用[2]，目前主要用于治療急性胰腺炎、休克、調(diào)節(jié)免疫功能等[3]。同時它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用越來越引起大家的重視，由于顱腦損傷和其他器官有不少相同的病理生理機制，推測UTI具有潛在的腦保護作用。有研究顯示，神經(jīng)生化標志物S100B蛋白及神經(jīng)元烯醇化酶（Neuron Specific Enolase，NSE）分別高度特異性的存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中，是目前最具有應(yīng)用前景的顱腦損傷標志物[4]。本研究擬通過監(jiān)測顱腦損傷大鼠血清S100B及NSE水平變化，結(jié)合神經(jīng)功能評分、腦組織含水量及腦組織缺損體積等其他指標，觀察UTI對顱腦損傷的腦保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，清潔級，體重250～300 g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。隨機分成假手術(shù)（sham operation，SO）組、創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）組、烏司他丁預(yù)處理（UTI pretreatment，UTI）組和生理鹽水對照（NaCl control，Control）組，每組12只。造模結(jié)束后SO組因麻醉死亡1只，UTI組死亡

2只，TBI組與Control組各死亡3只。

1.2 用藥方法及模型制作 UTI組連續(xù)3 d給予UTI 300 000 U/（kg·d）腹腔注射后建立TBI模型。生理鹽水對照組連續(xù)3 d給予0.9%NaCl腹腔注射后建立TBI模型。

參照Feeney等[5]自由落體顱腦損傷模型，室溫條件下，2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，俯臥位固定于底板上，固定頭部，剪去頂毛并消毒，沿正中矢狀線切開頭皮，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm、中線旁開2.5 mm處鉆一直徑5 mm的骨窗，保持硬腦膜完整，將直徑4.5 mm的圓錐形撞擊端置于骨窗硬膜外，用20 g砝碼由30 cm高度自由下落撞擊撞擊端，造成右頂葉腦挫裂傷，充分止血后，骨蠟封閉骨窗，碘伏消毒傷口后縫合頭皮。將大鼠放置在保暖的加熱箱內(nèi)，維持大鼠的正常體溫（37.0±0.5） ℃，麻醉自由落體復蘇后放回飼養(yǎng)籠。假手術(shù)組除了沒有撞擊過程采用同樣的麻醉及手術(shù)操作。

1.3 神經(jīng)功能缺損評分 采用改良的神經(jīng)功能缺損評分[6]對上述四組大鼠分別于6 h、12 h、24 h、3 d

進行神經(jīng)功能的評估，評分標準分為大鼠的肢體運動、感覺、反射和平衡協(xié)調(diào)性等，評分范圍在0～18分，分數(shù)越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.4 采血檢測血清S100B蛋白及NSE水平 各組分別于傷后6 h、12 h、24 h、3 d經(jīng)尾靜脈采血1 mL，全部標本在30 min內(nèi)以2500 r/min離心10 min，取上層血清保存于-70 ℃低溫冰箱備用統(tǒng)一檢測。檢測操作步驟完全按照說明書進行。

1.5 腦組織含水量的測定 分別在傷后24 h和3 d，從上述四組中各隨機選取3只大鼠，斷頭取腦組織，用濾紙仔細吸凈清除腦組織表面的血漬。沿矢狀縫切開，區(qū)分兩側(cè)大腦半球，精密電子天平稱濕重；置80 ℃烤箱中，連續(xù)烘烤48 h至恒重（最后兩次質(zhì)量差<0.2 mg）后稱干重。按Elliott公式計算腦組織含水量（%）：腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 腦組織固定、包埋后行石蠟切片 各組其余大鼠于傷后3 d全部斷頭去腦，注意仔細分離整個大腦組織，然后將腦組織置于4%多聚甲醛中固定2～3 d。經(jīng)過梯度酒精脫水，二甲苯透明和浸蠟后進行包埋。包埋好的腦組織標本用切片機進行切片。從腦損傷區(qū)域前緣的1 mm開始切片，每隔300 μm切1張，每張厚度為4 μm，直到損傷區(qū)后緣。

1.7 腦損傷體積測定 石蠟切片完成后，行HE染色，染色完成后等待片子晾干后在Olympus BX51型熒光顯微鏡明場下拍照，將拍的照片用Imagetool軟件處理，計算腦損傷的體積。損傷側(cè)大腦半球及對側(cè)大腦半球體積計算的方法按照公式

Σ（An+An+1）×d/2計算。其中A為相對應(yīng)腦片的面積，n為用以計算切片的張數(shù)，d是相鄰兩個切片之間的距離（300 μm）。損傷體積=對側(cè)大腦半球體積-損傷側(cè)大腦半球的體積。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，連續(xù)計量資料用（x±s）表示，兩組比較采用Students t檢驗，多組間比較作單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)合Newman.Keuls法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果 創(chuàng)傷后6 h，SO組與UTI組、Control組、TBI組比較神經(jīng)功能缺損評分較低（P<0.05），UTI組、Control組、TBI組三組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），證明造模成功。創(chuàng)傷后12 h，UTI組、Control組、TBI組三組相互比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與創(chuàng)傷后6 h比較，組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后24 h，UTI組、Control組、TBI組三組神經(jīng)功能缺損評分均下降，UTI組下降較明顯，與Control組、TBI組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Control組與TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與創(chuàng)傷后12 h比較，UTI組、Control組、TBI組三組組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。創(chuàng)傷后3 d，UTI組、Control組、TBI組三組神經(jīng)功能缺損評分均持續(xù)下降，UTI組與Control組及TBI組比較下降均較明顯（P<0.05），Control組與TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與創(chuàng)傷后6、12、24 h比較，UTI組、Control組、TBI組三組組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。SO組神經(jīng)功能缺損評分在四個時間點組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 腦組織含水量的變化 創(chuàng)傷后24 h，UTI組、Control組、TBI組三組與SO組比較腦組織含水量均較高（P<0.05）。UTI組與Control組及TBI組比較腦組織含水量較低（P<0.05），Control組與TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后3 d，UTI組、Control組、TBI組三組腦組織含水量均下降，與創(chuàng)傷后24 h比較，組內(nèi)差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。UTI組與Control組及TBI組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Control組與TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 腦損傷體積結(jié)果 SO組腦組織無損傷，UTI組與Control組及TBI組比較腦組織損傷體積均較小（P<0.05），Control組與TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.4 大鼠血清S100B蛋白水平的變化 創(chuàng)傷后6 h，UTI組、Control組、TBI組血清S100B含量與SO組比較均較高（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清S100B含量均較低（均P<0.05），Control組與TBI組血清S100B含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后12 h，UTI組、Control組、TBI組血清S100B含量較創(chuàng)傷后6 h呈下降趨勢（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清S100B含量均較低（P<0.05），Control組與TBI組血清S100B含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后24 h，UTI組、Control組、TBI組血清S100B含量較創(chuàng)傷后12 h均呈持續(xù)下降（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清S100B含量均較低（均P<0.05），Control組與TBI組血清S100B含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后3 d，UTI組、Control組、TBI組血清S100B含量較創(chuàng)傷后24 h略高（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清S100B含量均較低（P<0.05），Control組與TBI組血清S100B含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。SO組血清S100B含量在四個時間點組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.5 大鼠血清NSE水平的變化 創(chuàng)傷后6 h，UTI組、Control組、TBI組血清NSE含量與SO組比較均較高（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清NSE含量均較低（均P<0.05），Control組與TBI組比較血清NSE含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后12 h，UTI組、Control組、TBI組血清NSE含量較創(chuàng)傷后6 h呈下降趨勢（均P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清NSE含量較低（P<0.05），Control組與TBI組血清NSE含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后24 h，UTI組、Control組、TBI組血清NSE含量較創(chuàng)傷后12 h呈持續(xù)下降（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清NSE含量均較低（P<0.05），Control組與TBI組血清NSE含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。創(chuàng)傷后3 d，UTI組、Control組、TBI組血清NSE含量較創(chuàng)傷后24 h略高（P<0.05），UTI組與Control組及TBI組血清NSE含量均較低（P<0.05），Control組與TBI組血清NSE含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。SO組血清NSE含量在四個時間點組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

近年來，隨著我國機動車使用的迅猛增加，交通事故引起的以TBI為主的多發(fā)傷的比例也在逐年上升[7]。有研究顯示，到2020年，TBI將超越其他疾病成為最主要的死亡及致殘原因，其導致的死亡率、殘疾率和功能障礙將成為公共健康的主要問題[8]。一般來說，TBI分原發(fā)性顱腦損傷和繼發(fā)性顱腦損傷，前者指受傷的暴力所引起的頭皮和顱骨傷，以及局部或廣泛的神經(jīng)血管傷；后者是在原發(fā)傷的基礎(chǔ)上因缺血缺氧引起的腦水腫、腦疝及顱內(nèi)出血等，而增加腦組織對損傷的耐受性或減少這些繼發(fā)性損害即成為目前神經(jīng)外科治療研究的重點。目前研究TBI的模型可以分為細胞模型和動物模型兩大類，考慮到細胞模型不能像動物模型很好的模擬TBI的真實發(fā)病過程，所以在本研究中，筆者用UTI對實驗SD大鼠連續(xù)3 d腹腔注射后，采用Feeney式自由落體打擊的方式制作動物TBI模型，該模型條件容易控制，設(shè)備造價相對便宜，其打擊的力量通過改變下落物體的重量和調(diào)整下落物體的高度來實現(xiàn)，同時我們采用去除顱骨來減少偏差，制作中度TBI模型。造模后評估顯示，造成的腦損傷的程度比較一致。

UTI是男性尿液中分離純化的一種糖蛋白，含有143個氨基酸，具有兩個活性功能區(qū)，是一種典型的Kuniz型蛋白酶抑制劑，兩個活性功能區(qū)均有很廣的抑酶譜，且不完全重疊，所以能夠同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性[9]；另外，UTI分解形成的低分子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用[10]。研究表明，UTI有多種特殊的藥理性質(zhì)：除對多種蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，還能抑制心肌抑制因子（MDF）的產(chǎn)生，改善休克時的循環(huán)狀態(tài)，對溶酶體膜有穩(wěn)定作用[11]。Li等[12]證明UTI能通過改善脾細胞增殖反應(yīng)和細胞因子釋放，促進免疫功能的恢復。Cao等[13]研究提示UTI在感染性結(jié)腸炎模型中抑制炎性因子的釋放。在本研究中，在造模后24 h和3 d分別從SO組、UTI組、Control組及TBI組四組中各隨機選取3只大鼠斷頭取腦，測腦組織含水量，結(jié)果顯示，UTI組SD大鼠在兩個時間點的腦組織含水量均明顯低于Control組（P<0.05），表明UTI可能減輕TBI后的繼發(fā)性腦水腫。而腦水腫以及由此引起的顱內(nèi)壓的增高是造成TBI患者死亡的主要原因[14]。雖然在本次實驗中，UTI組和Control組腦含水量的差別不是很大，但值得注意的是，TBI后腦含水量的輕度增高都會導致顱內(nèi)壓的顯著增加和預(yù)后的變差。血腦屏障的破壞是導致TBI后腦水腫重要原因[15]。而在心臟驟停引起腦組織缺血再灌注損傷的動物模型中，UTI被證明可以通過減少一氧化氮的代謝產(chǎn)物而減少血腦屏障的破壞，從而減少大腦皮層神經(jīng)元的死亡[16]。因此，筆者推測，UTI有可能通過保護血腦屏障的破壞而減輕了TBI后的腦水腫。另外，本研究采用HE染色來評估腦損傷的體積，結(jié)果顯示，UTI組SD大鼠在受打擊后3 d的腦組織缺損體積明顯小于Control組（P<0.05），這表明UTI減輕了腦組織的損傷，在TBI后腦組織的修復過程中可能也發(fā)揮了重要的作用。同時，在大鼠受打擊后6 h、12 h、24 h、3 d分別對四組大鼠從肢體運動、感覺、反射和平衡協(xié)調(diào)性等方面進行神經(jīng)功能缺損評分，結(jié)果表明，UTI組和Control組神經(jīng)功能缺損評分在傷后24 d和3 d存在著明顯差異（P<0.05），筆者推測這可能與UTI降低腦水腫，減少腦損傷體積有關(guān)。

目前，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的確診大部分依賴于臨床表現(xiàn)及臨床影像學資料，而顱腦損傷后對損傷程度的定量評估以及疾病轉(zhuǎn)歸、早期預(yù)測已成為臨床關(guān)注的熱點，相關(guān)生物標志物的篩選研究是其中的一個重要方面。理想的腦損傷生物標志物應(yīng)具有高度的特異性和敏感性，同時具有傷后立即釋放、傷后早期即可檢出和可快速檢測等特點，已有報道許多蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)及脂質(zhì)分子可作為判斷TBI腦損傷可行的生物學指標，而S100B蛋白和NSE是其中較為經(jīng)典且研究較多兩種。S100B蛋白是一種小分子量酸性鈣結(jié)合蛋白，高濃度存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞和中樞周圍神經(jīng)系統(tǒng)的施旺細胞和朗格漢斯細胞以及垂體前葉細胞內(nèi)，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大多數(shù)由星形膠質(zhì)細胞合成和分泌。S100B蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)的特異性腦功能蛋白，具有營養(yǎng)神經(jīng)細胞，參與細胞能量代謝及信號傳導等作用[17]。正常成人血清中S100B蛋白含量較小，通常較難測出。S100B蛋白在腦缺氧缺氧損傷后

20 min，血清S100B蛋白即可達到峰值。這一變化是因為低氧使膠質(zhì)細胞的細胞膜完整性遭到破壞，釋放S100B蛋白進入腦脊液，同時缺氧還造成血腦屏障受損，通透性增高，使S100B蛋白通過血腦屏障進入血液，血清中蛋白濃度迅速升高[18]。Chabok等[19]認為血清中檢測到S100B蛋白也是血腦屏障受損的標志。NSE是一種由亞基組成的烯醇化酶二聚體同工酶，特異性地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中，其含量約占腦全部可溶性蛋白的1.5%，周圍神經(jīng)NSE的含量遠遠低于腦內(nèi)[20]。正常血液中NSE含量極低，人體研究顯示，當缺血、缺氧時，NSE從受損崩解的神經(jīng)元細胞內(nèi)釋放出來，通過已破壞的血腦屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)中[21]。NSE不與細胞內(nèi)肌動蛋白結(jié)合，血清NSE含量和腦損傷嚴重程度呈正相關(guān)，損傷越嚴重，血清NSE含量越高[22]。在本研究中，分別于傷后6 h、12 h、24 h、3 d四個時間點對四組大鼠采血進行血清S100B及NSE濃度檢測。結(jié)果顯示，在打擊后6 h，TBI組血清S100B及NSE濃度即較SO組大幅增高，表明打擊作用導致了實驗大鼠血清S100B及NSE含量急劇增加，反過來也提示血清S100B及NSE濃度的變化可以反映大鼠顱腦受損情況。隨著大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，血清S100B及NSE濃度也在降低，提示血清S100B及NSE濃度與神經(jīng)受損呈正相關(guān)性。通過比較UTI組與Control組血清S100B及NSE濃度發(fā)現(xiàn)，UTI組血清S100B及NSE濃度在傷后6 h、12 h、24 h、

3 d四個時間點均明顯低于Control組（P<0.05）。結(jié)合S100B及NSE在人體存在的部位及釋放特點，推測烏司他丁可以通過保護膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元細胞膜完整性、促進血腦屏障修復等降低血清S100B及NSE濃度。從傷后6～24 h，大鼠血清S100B及NSE濃度呈持續(xù)下降的趨勢，但在傷后3 d，大鼠血清S100B及NSE濃度較傷后24 h有所上升，呈現(xiàn)一個雙峰的波形，推測這可能與繼發(fā)性TBI導致腦組織進一步受損，增加了膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞細胞膜及血腦屏障的破壞，從而增加了S100B蛋白及NSE血清的釋放。結(jié)合上述的文獻，筆者認為烏司他丁可能通過清除體內(nèi)氧自由基、減少炎癥因子的釋放，調(diào)控細胞內(nèi)外滲透壓，維持細胞內(nèi)外水和電解質(zhì)平衡，減輕腦水腫的發(fā)生和程度，從而減少細胞死亡，保護受損腦組織，減緩TBI的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，烏司他丁腹腔注射能夠降低TBI的腦水腫、減少腦損傷體積、改善TBI神經(jīng)功能缺損及降低實驗大鼠血清S100B及NSE濃度，具有神經(jīng)保護的作用。

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（收稿日期：2017-12-04） （本文編輯：程旭然）