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    烏司他丁對機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織中TNF—α的影響

    2017-02-27 18:07:14閔軍潘定斌雷霆
    中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新 2016年32期
    關(guān)鍵詞:烏司他丁

    閔軍 潘定斌 雷霆

    【摘要】 目的:建立機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織,觀察TNF-α在機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織中TNF-α的變化規(guī)律,探討烏司他丁對呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)的治療機(jī)制是否與抑制TNF-α的活化有關(guān)。方法:采用大潮氣量通氣建立呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷兔模型,模型成立后30、60、120、180、240 min,抽取動脈血作血氣分析,采用ELISA法檢測血清肺組織中TNF-α的含量,采用HE染色觀察肺組織病理變化,運(yùn)用Real-time PCR、Western Blot檢測肺組織中TNF-αRNA、蛋白的表達(dá)。結(jié)果:家兔在大潮氣量機(jī)械通氣后,隨著時間的增加血清中、肺組織中TNF-α表達(dá)顯著增加,而采呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷模型兔在使用烏司他丁干預(yù)后,動脈血中的PaO2較前有所回升,血清與肺組織中TNF-αmRNA與蛋白的表達(dá)同大潮氣量組相比有明顯著上升(P<0.05)。結(jié)論:烏司他丁對呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過下調(diào)TNF-α的表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的。

    【關(guān)鍵詞】 烏司他??; 呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷; 大潮氣量; TNF-α

    【Abstract】 Objective:The establishment of ventilator induced lung injury in a rabbit model of lung tissue,to observe the changes of TNF-α in mechanical ventilation induced lung injury model of rabbit lung tissue alpha,to explore the therapeutic mechanism of Ulinastatin on VILI and TNF-α.Method:The injury rabbit model of high tidal volume ventilation was established,after 30,60,120,180 and 240 min,arterial blood for blood gas analysis.TNF-α in serumwere measured by ELISA.The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining.The expression of TNF-αRNA and protein in lung tissue was detected by PCR Real-time and Blot Western.Result:After mechanical ventilation,the expression of TNF-α in serum and lung tissue increased significantly.Ulinastatin interved ventilator induced lung injury model in rabbits and rabbit arterial blood PaO2 increased,in serum and lung tissue TNF-α expression were compared with those of the earlier high tidal volume group improved significantly(P<0.05).Conclusion:Ulinastatin on ventilator induced lung injury has a protective effect, he mechanism may be by down regulating the expression of TNF-α,inhibit inflammatory reaction to achieve.

    【Key words】 Ulinastatin; Ventilator associated lung injury; Tidal volume; TNF-α

    First-authors address:The Second Hospital of Fuzhou Affiliated to Xiamen University,F(xiàn)uzhou 350007,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.005

    呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)是機(jī)械通氣最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,主要由于過度機(jī)械通氣誘發(fā)或引起的急性肺損傷,危害性大,如果發(fā)現(xiàn)和處理不當(dāng)可導(dǎo)致患者死亡[1]。VILI屬于急性肺損傷,中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞會在損傷后于肺內(nèi)聚集,并釋放的腫瘤壞死因子TNF-α等眾多炎性介質(zhì),并啟動早期炎癥反應(yīng),而TNF-α等炎癥因子又對炎癥反應(yīng)的維持起重要作用[2-3]。大潮氣量機(jī)械通氣致呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷時在繼發(fā)的急性炎癥反應(yīng)的始動與發(fā)展環(huán)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。烏司他丁對TNF-α等炎癥因子具有抑制作用,能減輕體內(nèi)的炎癥反應(yīng),值得研究。烏司他丁(Ulinastatin,UTI)是由男性尿液中提取的絲氨酸蛋白酶抑制劑,分子量為67 kD,對TNF-α等炎癥因子具有抑制作用,從而減輕炎癥反應(yīng)[4-5]。本研究觀察TNF-α在機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織中的變化規(guī)律,探討烏司他丁對VILI的治療機(jī)制是否與抑制TNF-α的活化有關(guān),并觀察烏司他丁對VILI的療效,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與藥物 雄性3月齡新西蘭家兔24只(清潔級),體重(2.50±0.48)kg[動物合格證:SCXK(滬)2004-0003,上海西普爾-必凱公司]。烏司他?。▏帨?zhǔn)字H19990133)300萬單位。

    1.2 實驗儀器與試劑 DEVIBISS公司NEB-2000呼吸機(jī);血氣ABL800血氣分析儀;PE生物9600DNA擴(kuò)增儀;ABI7500型實時定量PCR儀;TNF-αELISA檢測試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司);RR036A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green I RR82LR(Takara) (大連寶生物工程公司);考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(建成生物研究所);TNF-α抗體(美國abcam公司),β-actin抗體(美國CST公司),Western Breeze(美國invitrogen公司),PVDF膜(Amersham公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 干預(yù)前準(zhǔn)備 耳緣靜脈進(jìn)針,戊巴比妥鈉麻醉,行氣管切開并插管,連接呼吸機(jī)。切開左側(cè)皮膚分離頸總動脈進(jìn)行動脈血采集。于右側(cè)頸靜脈置靜脈套管針開放靜脈通道,以每小時10 mL/kg持續(xù)輸注葡萄糖生理鹽水,補(bǔ)液并維持血壓穩(wěn)定。準(zhǔn)備階段的呼吸機(jī)通氣方式:容量控制(CMV):VT 8 mL/kg,F(xiàn)iO2∶40%,I∶E=1∶2,呼氣末正壓(PEEP)3 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa),維持呼吸頻率30~40次/min、PaCO2 5.32 kPa左右。

    1.3.2 分組 穩(wěn)定機(jī)械30 min后記錄各項基礎(chǔ)參數(shù),并將此時時間點記錄為0 h。將實驗動物隨機(jī)劃分,每組8只,不同組予不同潮氣量和通氣時間:(1)常規(guī)潮氣量組:繼續(xù)初始通氣條件VT 8 mL/kg通氣。(2)大潮氣量烏司他丁組:調(diào)節(jié)呼吸機(jī)至VT 40 mL/kg、呼吸頻率8次/min。首次50 000 U/kg注射烏司他丁后,持續(xù)靜脈輸注5000 U/(kg·h)。(3)大潮氣量對照組:調(diào)節(jié)呼吸機(jī)至VT 40 mL/kg、呼吸頻率8次/min。持續(xù)靜脈輸注地塞米松0.5 mg/(kg·h)。

    1.3.3 檢測指標(biāo) 在分組操作完成后30、60、120、180、240 min,抽取動脈血行血氣分析,抽取靜脈血檢測血清中TNF-α的含量。取血完處死后取肺組織,用于mRNA與蛋白的檢測。

    1.3.3.1 血清肺組織中TNF-α含量的檢測 靜脈血離心取血清,肺組織液氮搗碎勻漿于組織稀釋液中,試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板上。并先后加入生物素、酶標(biāo)底物,37 ℃溫育60 min。加入終止液終止反應(yīng),顯色15 min后,于酶標(biāo)儀450 nm讀取OD值。

    1.3.3.2 肺組織TNF-α蛋白的檢測 提取肺組織的蛋白,測定蛋白濃度后,以30 μg/道上樣,進(jìn)行SDS-PGEE凝膠電泳, 然后采用半干轉(zhuǎn)將膠上蛋白印至PVDF膜。室溫封閉30 min。將1∶5000稀釋的抗體封閉膜1 h,洗膜6次后將二抗室溫封閉30 min,后再洗膜6次。將發(fā)光底物與膜在室溫下孵育5 min,曝光、顯影。應(yīng)用Phoretix 1D生物電泳圖象分析系統(tǒng)讀每個條帶的光密度值。

    1.3.3.3 肺組織TNF-αmRNA的檢測 TNF-α引物:F 5CGCAAGAGTGTCTGGCGCAA 3,R 5GGATGACGCG GAG ACGGA3,產(chǎn)物長度145 bp。內(nèi)參β-actin引物:F 5AGGCTGTCTTGTCCTGTA 3,R 5ATGTCACGCCAGATTTCC 3,產(chǎn)物長度176 bp。采用Trizol法提取肺組織RNA,抽提后的RNA加入溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢驗RNA是否降解,在確定無降解后測定RNA濃度,按試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后在ABI7500上擴(kuò)增,得到擴(kuò)增曲線與CT值。采用2-△△CT計算mRNA的表達(dá)量。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,比較采用 字2檢驗。ONE-WAY ANOVA(單向方差分析)組間數(shù)據(jù)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 動脈血氣改變與常規(guī)潮氣量組比較 大潮氣量對照組動物在創(chuàng)傷后30 min,PaO2顯著降低(P<0.05),并在4 h內(nèi)持續(xù)保持低水平。大潮氣量烏司他丁組動物PaO2于30 min先降低,1 h后持續(xù)有所升高,與大潮氣量對照組比較有顯著升高但低于同時期常規(guī)潮氣量組(P<0.05)。見表1。

    2.2 血清肺組織中TNF-α含量的檢測結(jié)果 創(chuàng)傷后大潮氣量組血清在TNF-α的含量逐漸升高,烏司他丁組明顯低于對照組組(P<0.05)。同時期常規(guī)潮氣量組血清中TNF-α則無明顯變化,且各時間段無明顯變化(P>0.05),見表2。而肺組織中TNF-α的表達(dá)量以大潮氣量對照組最高為(98.43±2.99)pg/mL,大潮氣量烏司他丁組次之為(89.69±6.38)pg/mL,常規(guī)潮氣量組最低為(75.32±3.21)pg/mL,其他兩組與同時期常規(guī)潮氣量組比較(P<0.05),其他兩組與同時期對照組比較(P<0.05)。

    2.3 不同組別肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá) qPCR擴(kuò)增曲線說明所采用的體系和條件符合要求(圖1)。同時,溶解曲線表明為特異性擴(kuò)增(圖2)。肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá)以大潮氣量對照組最高為1,大潮氣量烏司他丁組次之為(0.534±0.033),常規(guī)潮氣量組最低為(0.774±0.042),各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4 不同組別肺組織中TNF-α蛋白的表達(dá) 大潮氣量對照組肺組織中TNF-α蛋白表達(dá)含量最高為(0.843±0.032),大潮氣量烏司他丁組次之為(0.489±0.015),常規(guī)潮氣量組最低為(0.194±0.028),各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    3 討論

    呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)是由于機(jī)械通氣導(dǎo)致肺損傷的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,病理上顯現(xiàn)為彌漫性肺損傷:肺泡外氣體、肺泡上皮與血管內(nèi)皮的廣泛破壞、肺水腫和肺不張等。VILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜:除氣壓傷、容量傷、肺萎陷傷外,免疫細(xì)胞和炎癥因子介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)也參與其中[7-9]。當(dāng)肺內(nèi)細(xì)胞感知機(jī)械力量刺激后,通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)激活炎癥細(xì)胞,誘導(dǎo)其釋放大量炎癥因子,導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,大量炎癥介質(zhì)釋放,并通過肺并進(jìn)入血液循環(huán),最終促進(jìn)和加重SRIS及MOF[10-11]。而其中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TNF-α等炎性介質(zhì)對啟動早期炎癥級聯(lián)反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的維持起著重要作用[12-14]。

    TNF是主要由激活的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的Ⅱ型膜蛋白,可與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合,實現(xiàn)細(xì)胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等生物學(xué)效應(yīng)的促進(jìn)作用。而在TNF家族中TNF-α不但是炎癥反應(yīng)過程中重要的啟動因子,還可誘導(dǎo)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、受體等合成和表達(dá)。同時可激活NF-κB信號通路,誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì),并相互作用??傊谑艿竭^度機(jī)械通氣時肺泡上皮細(xì)胞受到牽拉而變形,繼而發(fā)生機(jī)械應(yīng)力衰竭,并伴隨胞膜破壞,導(dǎo)致炎性細(xì)胞分泌TNF-α增多,介導(dǎo)了NF-κB信號通路的活化,最終誘導(dǎo)肺內(nèi)細(xì)胞的凋亡[15-17]。

    本研究結(jié)果顯示:VILI損傷模型兔在大潮氣量機(jī)械通氣后,隨著時間的增加,血清中、肺組織中TNF-α表達(dá)顯著增加,提示其在VILI的發(fā)展過程中可能起到一定的作用。肺組織TNF-α表達(dá)在VILI的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,烏司他丁對VILI有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過下調(diào)TNF-α的表達(dá),抑制NF-κB信號通路的活化來實現(xiàn)的[18-20]。但是,參與VILI的炎癥因子眾多,TNF-α與其他細(xì)胞因子也有協(xié)同作用,轉(zhuǎn)錄水平的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。烏司他丁對肺的保護(hù)作用是否還有其他的信號通路傳導(dǎo)參與,仍需要更進(jìn)一步的研究。

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    (收稿日期:2016-05-19) (本文編輯:程旭然)

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