金柚提取物對糖尿病腎病大鼠腎組織中p38MAPK炎癥信號通路的影響

鐘志華　康戰(zhàn)方

【摘要】 目的：研究金柚提取物對糖尿病腎病大鼠腎組織中磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）及細(xì)胞核中核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65（NF-κBP65）表達(dá)的影響。方法：采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，分為正常對照組、糖尿病腎病模型組、陽性藥物組（嗎替麥考酚酯膠囊，11 mg/kg）、金柚提取物組（25、50 mg/kg），8周后測定各組大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白并留取腎組織。Western blot測定腎皮質(zhì)中p-p38MAPK及胞核中NF-κB P65蛋白表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定血清白細(xì)胞介素8（IL-8）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、纖維連接蛋白（FN）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）等含量。結(jié)果：與正常對照組比較，糖尿病腎病模型組大鼠血清BUN、Scr含量，24 h尿蛋白，IL-8、TGF-β、FN、PAI-1水平、腎組織p-p38MAPK及胞核中NF-κB P65蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05）。經(jīng)過治療后，與糖尿病腎病模型組比較，陽性藥物組和金柚提取物組（25、50 mg/kg）大鼠血清中各指標(biāo)含量及各蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：金柚提取物對大鼠糖尿病腎病具有保護作用，其作用機制可能與調(diào)控腎臟組織中p38MAPK/NF-κBP65信號通路、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 金柚提取物； 糖尿病腎?。?炎癥

Effect of Extracts from Golden-pomelo on Expression of p38 Mitogen-activated Protein Kinase in Kidney of Diabetic Nephropathy Rats/ZHONG Zhihua，KANG Zhanfang.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：032-036

【Abstract】 Objective：To study the effect of extracts from golden-pomelo on expression of p38 mitogen-activated protein kinase（p-p38MAPK） and nuclear factor κB P65（NF-κB P65） in the kidney of diabetic nephropathy rats.Method：The diabetic rats were induced by a single intraperitoneal injection of Streptozotocin.The rats were randomly divided into normal control group，diabetic nephropathy model group，positive drug group and extracts from golden-pomelo treatment group.The blood urea nitrogen（BUN），serum creatinine（Scr） and 24 h urine protein of each group were measured.The content of p-p38MAPK and NF-κB P65 was determined by Western blot.The serum interleukin 8（IL-8），transforming growth factor-β（TGF-β），fibronectin（FN） and fibrinolytic enzyme activators inhibitor 1（PAI-1） were detected with the ELISA method.Result：Compared with the normal control group，BUN，Scr，24 h urine protein，IL-8，TGF-β，F(xiàn)N，PAI-1，p-p38MAPK and NF-κB P65 protein of the kidney in the diabetic nephropathy model group were obviously enhanced（P<0.05）.Compared with the diabetic nephropathy model group，BUN，Scr，24 h urine protein，IL-8，TGF-β，F(xiàn)N，PAI-1，p-p38MAPK and NF-κB P65 protein of the kidney in positive drug control group and extracts from golden-pomelo treatment group were significantly reduced（P<0.05）.Conclusion：The extracts from golden-pomelo can protect diabetic rats kidney possibly by regulation p38MAPK/NF-κB signaling pathway to anti-inflammatory mechanism.

【Key words】 Extracts from golden-pomelo； Diabetic nephropathy； Inflammatory

First-authors address：The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.008

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）已成為終末期腎病的主要因素，而炎癥的發(fā)病機制貫穿于整個DN的進(jìn)展期[1-2]。炎癥細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等活化后在腎組織中浸潤，產(chǎn)生多種炎癥因子和介質(zhì)，誘導(dǎo)啟動多條炎癥信號通路，導(dǎo)致級聯(lián)式瀑布反應(yīng)，引起腎組織加速損傷[3]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）信號通路及其下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）被認(rèn)為是DN腎組織炎癥反應(yīng)的經(jīng)典途徑，且已有多種中藥復(fù)方或其提取物、單體可以通過抑制腎組織中p38MAPK信號通路調(diào)節(jié)炎癥的過反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞平衡等，改善DN腎組織炎癥損傷，延緩DN疾病進(jìn)展[4-5]。本研究擬通過鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立DN大鼠模型，觀察金柚提取物對腎組織中炎癥信號通路的影響，探討金柚提取物對DN的保護作用及機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 金柚產(chǎn)自廣東梅州，清水洗干凈后切片，晾曬干燥后磨粉，過40目篩后，按照100 mg粉末∶95%乙醇1 mL比例超聲30 min后，取得過濾液干燥后獲得粉末待用。鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、尿蛋白、白細(xì)胞介素8（IL-8）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、纖維連接蛋白（FN）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）均購買自南京建成生物有限公司；小鼠抗大鼠單克隆抗體p-p38MAPK、NF-κB P65購自美國Santa Crun公司；全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒購自北京博奧森生物公司；化學(xué)發(fā)光液和硝酸纖維素膜購自美國Santa Crun公司；鏈脲佐菌素（STZ）干粉購自美國Sigma公司。

1.2 主要儀器 血糖儀（羅氏公司）；3500化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)、Power-pac200電泳儀（美國BIO-RAD公司）；倒置顯微鏡（德國Leica公司）；Infinite M2000 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士）；FJ-2000高速分散勻質(zhì)器（常州）；超低溫冰箱（美國Thermo公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 實驗動物 SD雄性大鼠，購自暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體重160～180 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（廣）2008-0009。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度（23±2）℃，濕度50%～70%，動物造模前禁食12 h，進(jìn)水自由。該實驗符合動物倫理學(xué)要求。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的建立 采用單次腹腔注射高劑量STZ（65 mg/kg）誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠及DN模型。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，糖尿病腎病模型組或糖尿病腎病模型+藥物組一次性腹腔注射STZ 65 mg/kg（溶解于0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液中，pH值為4.5）。正常對照組注射檸檬酸緩沖液。STZ注射后第3天和第7天尾靜脈采血測血糖值，連續(xù)兩次血糖值≥16.7 mmol/L確定為造模成功。

1.4.2 分組與給藥 將造模成功的大鼠按照隨機數(shù)表法分為糖尿病腎病模型組，陽性藥物組（嗎替麥考酚酯膠囊，上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031240，11 mg/kg，生理鹽水配置成11 mg/mL），金柚提取物組（25、50 mg/kg，將金柚提取物用生理鹽水配置成10 mg/mL），每組8～9只。10只正常大鼠作為正常對照組。注射STZ一周后開始給藥。所有大鼠每日早晨灌胃一次，模型組和對照組按照體重給予等體積的生理鹽水。

1.4.3 標(biāo)本的采集與處理 給藥7周后用代謝籠收集每個大鼠的24 h尿液，用于測定尿白蛋白。給藥8周后處理動物，麻醉后心臟采血10 mL，3000 r/min離心10 min，取上清，-80 ℃保存直至進(jìn)一步實驗。血液中BUN、Scr、IL-8、TGF-β、FN、PAI-1的檢測及24 h尿白蛋白測量均按照商業(yè)試劑盒步驟進(jìn)行。取腎皮質(zhì)保存于-80 ℃保存直至進(jìn)一步實驗。

1.4.4 Western blot法檢測腎組織中p-p38MAPK和胞核中NF-κB P65蛋白的表達(dá) 每組選取3只動物檢測腎組織p-p38MAPK和胞核中NF-κB P65蛋白的表達(dá)。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟提取組織中蛋白含量，并經(jīng)BCA試劑盒定量，-80 ℃冰箱保存待用。蛋白樣品加5×上樣緩沖液煮沸5 min冷卻，開始SDS-PAGE。商業(yè)化10% SDS-PAGE分離膠，插入梳齒后，孔中加入變性蛋白10 μL，左側(cè)Marker加樣孔中加5 μL的Marker。穩(wěn)壓120 V電泳，將電泳盒放入冷水浴中，溴酚藍(lán)至分離膠下緣1 cm左右時，結(jié)束電泳。制作三明治，轉(zhuǎn)膜槽放入預(yù)冷的緩沖液中，恒壓100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h。取出PVDF膜在牛奶封閉液中4 ℃孵育4 h。小鼠抗大鼠單克隆抗體p-p38MAPK、NF-κB P65一抗（1∶1 000）稀釋液，與PVDF膜4 ℃搖床孵育過夜。4 ℃預(yù)冷PBS洗液沖洗6次，每次10 min，辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠二抗（1∶10 000）稀釋，常溫與PVDF 膜孵育2 h后，沖洗3次，每次10 min。將發(fā)光液滴在PVDF膜上，將膜放入預(yù)熱的凝膠成像系統(tǒng)檢測。用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參（β-action）的灰度值的比值表示，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用破解SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（x±s）表示，符合正態(tài)分布組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 與對照組大鼠比較，糖尿病腎病模型組大鼠出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀，毛色色澤暗淡、精神萎靡，活動較少，隨著病程加重，體重進(jìn)行性降低；經(jīng)嗎替麥考酚酯膠囊及金柚提取物治療后，上述癥狀均好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠血清中BUN、Scr、24 h尿蛋白比較 與正常對照組比較，糖尿病腎病模型組大鼠血清中BUN、Scr、24 h尿蛋白含量均顯著升高（P<0.05）；與糖尿病腎病模型組比較，陽性藥物組和金柚提取物組均能顯著降低大鼠血清BUN、Scr、24 h尿蛋白含量（P<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠血清中IL-8、TGF-β、FN、PAI-1比較 與正常對照組比較，糖尿病腎病模型組大鼠血清中IL-8、TGF-β、FN、PAI-1含量均顯著升高（P<0.05）；與糖尿病腎病模型組比較，陽性藥物組和金柚提取物組均能顯著降低血清中IL-8、TGF-β、FN、PAI-1的含量（P<0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠腎組織中p-p38MAPK比較 與正常對照組比較，糖尿病腎病模型組大鼠腎組織中p-p38MAPK表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與糖尿病腎病模型組比較，陽性藥物組和金柚提取物組均能顯著降低腎組織中p-p38MAPK表達(dá)水平（P<0.05）。見圖1和表3。

2.5 各組大鼠腎組織細(xì)胞核中NF-κB P65比較 與正常對照組比較，糖尿病腎病模型組大鼠腎組織細(xì)胞核中NF-κB P65表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與糖尿病腎病模型組比較，陽性藥物組和金柚提取物組均能顯著降低腎組織細(xì)胞核中NF-κB P65表達(dá)水平（P<0.05）。見圖1和表3。

3 討論

DN是糖尿病患者嚴(yán)重的并發(fā)癥，一旦出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，如不及時逆轉(zhuǎn)，則可能導(dǎo)致腎功能衰竭，只能采用透析治療[7-8]。已有許多研究表明，炎癥反應(yīng)在DN的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要角色，因此如何尋找有效的抗炎藥物治療對逆轉(zhuǎn)DN尤為重要[9-10]。

p38MAPK參與正常免疫和炎癥反應(yīng)，參與巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的功能性反應(yīng)，通過趨化現(xiàn)象、顆粒胞外分泌、粘附及凋亡等調(diào)控T細(xì)胞的分化和凋亡[11-12]。糖尿病狀態(tài)下，p38MAPK在腎臟被激活，參與腎臟組織的炎癥反應(yīng)及凋亡[13]。p38MAPK可以調(diào)控多種炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。NF-κB作為絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞受到外界信號（如脂多糖、特異的細(xì)胞因子）刺激時，引起一系列連鎖的酶促反應(yīng)，促使下游IκB-α發(fā)生磷酸化而與NF-κB解離，NF-κB激活而移位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA上相應(yīng)位點結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[14-15]。NF-κB作為多種炎癥信號通路的最終匯合點，對于發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點帶來一點的難度。NF-κB可以促進(jìn)IL-8、TGF-β、FN及PAI-1等炎癥介質(zhì)的合成與釋放，進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子，血小板衍化生長因子等細(xì)胞因子及分泌細(xì)胞外基質(zhì)加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致纖維連接蛋白FN導(dǎo)致腎小球硬化[16-17]。因此，能否成功干預(yù)p38MAPK/NF-κB信號通路成為治療DN的重要手段。

現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)金柚中富含多種黃酮類化合物，具有抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂等功能，對預(yù)防和治療糖尿病、肥胖以及心腦血管方面的疾病有重要作用[18-20]。筆者前期的體外研究表明，金柚提取物能特異性激活雌激素受體β[1]。而雌激素受體β能調(diào)節(jié)炎癥信號通路。本研究筆者進(jìn)一步在體內(nèi)探討金柚提取物對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠腎病模型中的保護作用，尤其是對腎組織中炎癥反應(yīng)通路的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過治療后，與糖尿病腎病模型組比較，陽性藥物組和不同濃度金柚提取物組（25、50 mg/kg）均能顯著降低大鼠血清BUN、Scr及24 h尿蛋白含量（P<0.05）。同時，藥物治療組血清中IL-8、TGF-β、FN及PAI-1水平亦均顯著降低（P<0.05）。Western blot顯示腎組織中p-p38MAPK及胞核中NF-κB P65蛋白表達(dá)均下調(diào)（P<0.05）。

綜上所述，金柚提取物對DN大鼠腎臟具有保護作用，其機制可能與調(diào)控腎臟組織中p38MAPK/NF-κB P65信號通路，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2017-12-18） （本文編輯：程旭然）