受膽固醇調節(jié)的變異剪接體及其意義

龐亞娜　趙晉楓　董元坤

【摘要】 目的：檢測人肝癌細胞中LDLR的變異剪接體LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12，HMGCS1的變異剪接體HMGCS1-?Exon2和HMGCR的變異剪接體HMGCR-Exon?13是否受膽固醇的調節(jié)。方法：建立高膽固醇模型組、低膽固醇模型組及正常組，提取不同模型組的RNA并進行反轉錄，采用Real-time PCR（RT-PCR）技術檢測LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13的mRNA的表達。結果：在高膽固醇模型組中，與正常組相比，LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2及HMGCR-Exon?13的mRNA的表達量與各基因全長相比均明顯升高（P<0.05）；而在低膽固醇模型組中，與正常組相比，上述的變異剪接體mRNA的表達量與各基因全長相比均明顯下降（P<0.05）。結論：LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2及HMGCR-Exon?13等變異剪接體受膽固醇的調節(jié)，并可能參與并調控膽固醇的代謝。

【關鍵詞】 選擇性剪接； 膽固醇； 變異剪接體

Cholesterol-regulated Variant Spliceosomes and Their Significance/PANG Yana，ZHAO Jinfeng，DONG Yuankun，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：018-022

【Abstract】 Objective：To detect whether LDLR，HMGCS1 and HMGCR alternatively spliced variants LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2 and HMGCR-?Exon13 regulated by cholesterol in human hepatocellular carcinoma cells.Method：The high cholesterol model group and the low cholesterol model group were established，and compared with the normal group.RNA extraction of different model cells was reverse transcribed，and Real-time PCR（RT-PCR） technology was used to detect mRNA expression of LDLR-?Exon4，

LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2 and HMGCR-?Exon13.Result：Compared with the normal group，mRNA expression of LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2 and HMGCR-?Exon13 were increased in the high cholesterol model group（P<0.05）.However，mRNA expression of LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2 and HMGCR-?Exon13 were decreased in the low cholesterol model group compared with the normal group（P<0.05）.Conclusion：LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2 and HMGCR-?Exon13 spliced variants are regulated by cholesterol and may participate in regulating the metabolism of cholesterol.

【Key words】 Alternative splicing； Cholesterol； Spliced variants

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.005

低密度脂蛋白受體（Low density lipoprotein receptor，LDLR）是一種表達豐富的膜糖蛋白，尤其在肝細胞中含量最高。LDLR與脂代謝關系密切，血漿中大部分膽固醇被肝細胞表面的LDLR清除。因此，該基因的異常可導致血漿膽固醇水平顯著上升。而高膽固醇血癥又是動脈粥樣硬化的首要危險因素，與冠心病、腦血管病的發(fā)病率直接相關[1-3]。

人類的羥甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶（HMGCR）是合成膽固醇的限速酶，膽固醇是糖皮質激素類固醇激素的前體，在血壓穩(wěn)態(tài)和高血壓中發(fā)揮著深遠的作用[4-5]。HMGCR催化HMG-CoA轉化為甲羥戊酸，一種合成膽固醇的中間產物，饑餓、激素等因素主要通過對HMGCR的活性及合成的影響而實現(xiàn)對膽固醇合成的調節(jié)[6-8]。羥甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）合成酶（HMGCS）催化乙酰乙酰CoA生成HMGCoA，這兩種酶都對膽固醇的調節(jié)有重要的作用[9-10]。

選擇性剪接（Alternative Splicing，AS）是基因的一個mRNA前體通過不同的剪接方式選擇，不同的剪接位點產生不同的mRNA剪接異構體過程，選擇性剪接是高等真核細胞在轉錄后水平調控基因表達以及產生蛋白質組多樣性的重要機制[11]。Tveten等[12]在人的8種不同組織和4種不同細胞系中提取總RNA，使用不同引物（RT-PCR分析）證實LDLR pre-mRNA存在很多變異剪接體。通過對外顯子1～8及外顯子3～10的分析發(fā)現(xiàn)了外顯子4的缺失，對外顯子7～14和外顯子11～17的分析發(fā)現(xiàn)了外顯子12的不表達。研究發(fā)現(xiàn)HMGCR經(jīng)歷外顯子13的選擇性剪接，HMG-CoA合酶（HMGCS1），擁有高度復雜的59 UTR，經(jīng)歷外顯子2跳躍[13-14]。與全長相比，選擇性剪接體結構的變化也會引起蛋白功能的變化，推測LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-Exon?13等變異剪接體可能與高膽固醇血癥密切相關。因此，本實驗選取HepG2細胞，應用PCR技術檢測，與正常組比較，LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2，HMGCR-Exon?13等變異剪接體在高膽固醇模型以及低膽固醇模型中，與其基因全長相比較mRNA的表達差異，初步明確了LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-Exon?13與高膽固醇血癥的密切關系?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 HepG2細胞系購于中科院昆明細胞庫。

1.2 主要試劑和器材 MEM培養(yǎng)基，無菌PBS購自武漢博士德生物有限公司，胎牛血清（FBS）購自依科賽生物科技（太倉）有限公司，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，脂蛋白缺乏人血清（LPDS），人低密度脂蛋白（Human LDL）購自上海昂羽生物技術有限公司，25-Hydroxycholesterol（25-HC）購自美國Sigma-Aldrich公司。4 ℃離心機購自德國Thermo公司，PCR儀和熒光定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司。除GAPDH為引用文獻外，其余引物根據(jù)Pubmed Gene提供的LDLR基因的RNA序列，用Primer Premier軟件設計，由華大基因合成，引物序列見表1。

1.3 方法

1.3.1 細胞分組 將細胞置于37 ℃ 5%CO2，95%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，待細胞生長至對數(shù)生長期且融合面積大于70%時，正常組用10%MEM培養(yǎng)，低膽固醇模型組用不同濃度的LPDS血清培養(yǎng)24 h，高膽固醇模型組加入不同濃度含25-Hydroxycholesterol的10%MEM培養(yǎng)和含不同濃度的LDL的10%MEM血清培養(yǎng)24 h。

1.3.2 普通PCR 提取正常組細胞的RNA，反轉錄成cDNA后，之后使用特異性引物進行普通PCR擴增。2%瓊脂糖凝膠，用熒光染料4S Green Plus預染，取10 μL PCR擴增產物電泳，紫外凝膠成像分析儀觀察并拍照，檢測正常細胞LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-?Exon13是否存在。

1.3.3 RT-PCR 提取不同分組細胞的RNA，反轉錄成cDNA后，以cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒，設定程序：95 ℃預變性30 s，

40個循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s），熔解曲線（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s）。分別檢測不同分組LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCR1-?Exon2、HMGCR-?Exon13 mRNA表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，用（Mean±SEM）表示所有數(shù)據(jù)，高、低膽固醇模型組與正常組比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HepG2細胞中LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-?Exon13等變異剪接體mRNA表達檢測 普通PCR檢測結果HepG2顯示中均有LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-Exon?13及其全長的mRNA表達，見圖1。

3 討論

新近的研究表明，表觀遺傳機制尤其是組蛋白修飾與選擇性剪接有密切的關系[15-16]，組蛋白修飾對于選擇性剪接調節(jié)的直接證據(jù)來自分析一系列基因的組蛋白修飾與選擇性剪接的關系[17]，研究發(fā)現(xiàn)一些基因的選擇性剪接依賴于多聚嘧啶束結合蛋白（PTB）剪接因子[18-20]。PTB可以與剪接因子U2AF競爭結合3剪接位點，從而對pre-mRNA的剪接起到負性調控作用[21]。有研究顯示，HepG2 細胞系轉染PTB的干擾RNA后，PTB mRNA 表達下降到68%，蛋白表達下調到66%[22]。此時，檢測到選擇性變異剪接體LDLR-?Exon4和LDLR-?Exon12表達均下調，說明LDLR是PTB作用的靶基因。文獻[23-34]報道，H3K36me3在基因外顯子上富集與選擇性剪接外顯子的跳躍有關。在依賴于PTB的選擇性剪接的外顯子中，高濃度的H3K36me3能招募染色質鍵合蛋白MRG15，通過蛋白質間的相互作用，MRG15招募剪接因子多聚嘧啶序列結合蛋（Polypyrimidine tract-binding protein，PTB），使PTB結合到相對較弱的選擇性外顯子上，從而抑制PTB依賴性選擇性外顯子的納入，誘導外顯子跳躍。因此，推測LDLR pre-mRNA的第4、12外顯子缺失，HMGCR pre-mRNA第13外顯子的缺失及HMGCS1 pre-mRNA第2外顯子是由PTB進行調節(jié)的，在高膽固醇血癥時，組蛋白H3K36的三甲基化水平在缺失外顯子周圍水平升高，可與染色質結合蛋白（MRG15）結合，MRG15又可與PTB相連，通過PTB與剪接因子U2AF競爭結合3剪接位點，從而影響外顯子使其被切除，LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13產物的比例將明顯上升，各基因全長表達下降，從而不能有效地降低血膽固醇。簡言之，組蛋白修飾可能在LDLR pre-mRNA的選擇性剪接中發(fā)揮了重要作用。

本文通過RT-PCR檢測高、低膽固醇模型組與正常組相比，LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13等變異剪接體表達確實受膽固醇的影響，與高膽固醇血癥有著密切關系，但是這些變化是否由于表觀遺傳修飾引起的，還需要進一步的研究。

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（收稿日期：2017-12-22） （本文編輯：程旭然）