水稻金屬硫蛋白基因(rgMT)遺傳轉(zhuǎn)化的紫花苜蓿耐鹽性分析

徐 暢，何 好，李國(guó)良，金淑梅

(1.東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，黑龍江 哈爾濱 150068)

紫花苜蓿(Medicagosativa)素有“牧草之王”和“維他命飼料”的美稱，是世界上利用最早、栽培最廣的一種優(yōu)良豆科牧草[1-2]，紫花苜蓿多數(shù)屬鹽堿敏感型[3]，適宜在輕度鹽堿土壤中種植[4]，50～200 mmol·L-1NaCl脅迫就會(huì)顯著降低紫花苜蓿的產(chǎn)量[5]，NaCl濃度為0.6%時(shí)，試管苗不能生根[6]。在高鹽條件下，植物的光合作用減弱，生長(zhǎng)受到抑制，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)植株萎蔫，甚至死亡現(xiàn)象[7]。在我國(guó)北方鹽堿土主要是堿性鹽，堿性鹽對(duì)植物的危害作用很大程度上有別于中性鹽，表現(xiàn)出比中性鹽更大的生態(tài)破壞力[8]。

近年來，一些與植物耐鹽機(jī)制有關(guān)的基因相繼被克隆并用于轉(zhuǎn)基因研究中，這些基因的表達(dá)不同程度地提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力。1986年，Deak等[9]首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了抗性苜蓿植株，此后利用基因工程技術(shù)提高苜?？鼓嫘砸殉蔀檐俎ＳN的重要途徑[10-15]。金屬硫蛋白基因能夠提高植物的抗鹽堿性，金屬硫蛋白是一種機(jī)體內(nèi)的快速反應(yīng)應(yīng)激蛋白，被認(rèn)為是清除羥自由基最強(qiáng)的生物活性物質(zhì)之一[16]。金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)最初是從馬的腎臟中提取出來的一類富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)[17]，植物金屬硫蛋白分為4類：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型[18]。棗(Ziziphusjujuba)[19]、水稻(Oryzasativa)[20]和大麥(Hordeumvulgare)[21]金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)錄水平在鹽和干旱處理后顯著上調(diào)，說明該基因與鹽有一定的應(yīng)答關(guān)系。從虎尾草(Chlorisvirgata)[22]、堿茅(Pucclinelliadistans)[23]、堿蓬(Suaedaglauca)[24]等植物中克隆出的Ⅱ型金屬硫蛋白遺傳轉(zhuǎn)化到酵母和擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，能提高轉(zhuǎn)基因酵母和擬南芥的抗性。

2014年，Jin等[25]從水稻中克隆出一個(gè)金屬硫蛋白基因(rgMT，登錄號(hào)：S57768)，研究發(fā)現(xiàn)該基因能提高植物的抗鹽堿性。“農(nóng)菁1號(hào)”苜蓿是利用零磁空間選育的適合東北地區(qū)種植的、抗寒、抗病、生物產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿品種[26]，紫花苜蓿多數(shù)屬鹽堿敏感型，為了獲得耐鹽性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因苜蓿，本研究將rgMT基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化到苜蓿品種“農(nóng)菁1號(hào)”中，在保持該品種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的條件下，進(jìn)一步提高苜蓿的耐鹽堿性，對(duì)提高鹽堿地區(qū)紫花苜蓿種植面積、提高苜蓿產(chǎn)量及利用大面積鹽堿荒地具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)所提供的紫花苜蓿品種“農(nóng)菁1號(hào)”為轉(zhuǎn)基因受體植物。

1.1.2遺傳轉(zhuǎn)化所用的菌株 利用東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的pMD18-T-rgMT質(zhì)粒，通過PCR技術(shù)在rgMT(帶終止子TAA)讀碼框的前后添加BamH1和SacI酶切位點(diǎn)后連接到pMD18-T載體上，將添加BamH1和SacI位點(diǎn)的rgMT的T載和以35S為啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pBI121分別進(jìn)行雙酶切，膠回收后利用T4連接酶 (Takara，Japan) 將rgMT基因連接到植物表達(dá)載體pBI121上，再利用電擊法將pBI121-rgMT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株EH105中，用東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法[27]，獲得了轉(zhuǎn)rgMT基因苜蓿株系，以T0代篩選出的轉(zhuǎn)基因植株分別單株自交產(chǎn)生的T3代種子作為試驗(yàn)材料。

1.2 轉(zhuǎn)基因苜蓿的鑒定

1.2.1PCR檢測(cè) 以質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以野生型植株為陰性對(duì)照，選出9株具有卡那霉素抗性、生長(zhǎng)健壯的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)T1代植株生長(zhǎng)至4～5枚葉片時(shí)，摘取植株上部的幼嫩葉片，用CTAB法提取植物的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，通過觀察特異條帶的有無，判斷目的基因是否存在。PCR檢測(cè)體系為20 μL，上游引物序列為：5′-ATGTCTTGCAGCTGTGGATCT-3′，下游引物序列為：5′-TTAGCAGTTGCAAGGGTTGCA-3′，引物由上海生工生物工程公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。電泳Marker為Takara公司生產(chǎn)的DL2000。

1.2.2Northern blot檢測(cè) 為確定rgMT基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中是否穩(wěn)定表達(dá)，采用Trizol提取法提取野生型和轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，參照Northern blot的方法[28]，以測(cè)序正確的rgMT的T載質(zhì)粒為模板,上游引物序列為：5′-ATGTCTTGCAGCTGTGGATCT-3′，下游引物序列為：5′-TTAGCAGTTGCAAGGGTTGCA-3′，以地高辛標(biāo)記代替dNTP產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為探針, 進(jìn)一步對(duì)這些轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了Northern blot檢測(cè)分析。

1.3 轉(zhuǎn)基因苜蓿的脅迫處理

1.3.1子葉期苜蓿耐鹽堿性表型分析 選擇大小一致、籽粒飽滿的野生型和轉(zhuǎn)基因的苜蓿種子(#2)，6%次氯酸鈉消毒15 min，滅菌的蒸餾水沖洗3次，放置在鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃培養(yǎng)箱中浸種，選露白一致的種子，播種到底部打孔的含有草炭土∶蛭石=3∶1的塑料營(yíng)養(yǎng)缽中，置于溫室中，保持相對(duì)濕度70%～80%，采用自然光照，晝/夜溫度為25 ℃/18 ℃，每盆定苗4株。在苜蓿生長(zhǎng)4周，只長(zhǎng)子葉沒有長(zhǎng)出真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的野生型和轉(zhuǎn)基因苜蓿幼苗，分別用水(CK)、NaCl(200、300、400 mmol·L-1)、NaHCO3(50、100、200 mmol·L-1)脅迫處理2 d，每盆50 mL透灌花盆，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2幼苗期苜蓿耐鹽堿性表型分析 在花盆中栽培8周的野生型和轉(zhuǎn)基因苜蓿(#2)分別選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗，分別用水(CK)、NaCl(200、300、400 mmol·L-1)、NaHCO3(50、100、200 mmol·L-1)脅迫處理15 d，每盆50 mL透灌花盆，每?jī)商煅a(bǔ)澆50 mL處理液，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定

苗齡8周的野生型和轉(zhuǎn)基因苜蓿經(jīng)過1.3.2中的NaCl和NaHCO3處理24 h后，取相同部位功能葉片，采用茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量，電導(dǎo)儀法測(cè)定質(zhì)膜透性，氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性[29]，紫外分光光度法測(cè)定過氧化氫(H2O2)含量[30]，取3次重復(fù)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2016進(jìn)行整理、計(jì)算并作圖。再通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因苜蓿的鑒定

2.1.1PCR檢測(cè) 選出9株具有卡那霉素抗性、生長(zhǎng)健壯的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其中6株轉(zhuǎn)基因苜蓿DNA和質(zhì)粒DNA擴(kuò)增出200 bp左右的目的片段條帶，而野生型苜蓿DNA和3株轉(zhuǎn)基因苜蓿DNA則沒有擴(kuò)增出目的條帶 (圖1 )，初步表明,已經(jīng)獲得了rgMT基因整合到農(nóng)菁1號(hào)苜蓿基因組中的轉(zhuǎn)基因苜蓿株系。

圖1 轉(zhuǎn)rgMT基因抗性植株的PCR鑒定Fig. 1 PCR identification of resistant plants transformed with the rgMT gene

M: 2 000 bp marker；CK+: 陽(yáng)性對(duì)照；CK-:陰性對(duì)照；#1-#9: 轉(zhuǎn)基因植株。

M: 2 000 bp marker；CK+: Positive control；CK-: Negative control；#1-#9: Transgenic plants.

2.1.2Northern blot檢測(cè) 對(duì)PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行Northern blot分析，野生型苜蓿為對(duì)照，苜蓿rgMT全長(zhǎng)基因標(biāo)記為探針，檢測(cè)rgMT基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的表達(dá)情況(圖2)，雜交結(jié)果表明，野生型苜?？俁NA未與探針雜交出條帶，#1和#8雜交出淡淡的條帶，#2，#4，#5，#7雜交出的帶型比較明顯，尤其是#2轉(zhuǎn)基因苜蓿，這說明被檢測(cè)的7個(gè)株系中基因均穩(wěn)定表達(dá)，rgMT基因成功遺傳轉(zhuǎn)化到紫花苜蓿中，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。

2.2 苜蓿耐鹽堿表型分析

2.2.1子葉期苜蓿耐鹽堿表型分析 在沒有脅迫處理的條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因苜蓿的葉形態(tài)都較為正常，生長(zhǎng)未受到抑制，兩者之間沒有差異。在200和300 mmol·L-1NaCl，50和100 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，野生型與轉(zhuǎn)基因苜蓿的生長(zhǎng)均受到抑制，野生型苜蓿的子葉生長(zhǎng)受抑制比轉(zhuǎn)基因苜蓿更明顯，但葉色均無明顯變化。在400 mmol·L-1NaCl，200 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，野生型與轉(zhuǎn)基因的葉色變黃，生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制，野生型子葉生長(zhǎng)更緩慢，出現(xiàn)干黃甚至死亡，而轉(zhuǎn)rgMT基因的植株受脅迫比野生型輕(圖3)。

2.2.2幼苗期轉(zhuǎn)基因苜蓿耐鹽堿性表型分析 對(duì)照組野生型與轉(zhuǎn)基因苜蓿的生長(zhǎng)都較為正常，兩者之間沒有明顯差異(圖4)。200 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，野生型與轉(zhuǎn)基因苜蓿生長(zhǎng)受到抑制，野生型和轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片變黃，野生型受傷害明顯，在300和400 mmol·L-1NaCl，100和200 mmol·L-1NaHCO3脅迫條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因苜蓿生長(zhǎng)都受到了嚴(yán)重的抑制，野生型的葉片變黃、萎蔫甚至死亡，而轉(zhuǎn)基因株系還帶綠色葉片，有存活的植株?？梢钥闯?，轉(zhuǎn)基因株系的抗逆性高于野生型。

2.3 苜蓿鹽脅迫下各種生理指標(biāo)的變化

2.3.1鹽脅迫下苜蓿脯氨酸含量變化 將野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株分別用不同濃度的NaCl和NaHCO3脅迫處理后，檢測(cè)其脯氨酸的積累情況(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有脅迫處理的情況下，野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量無明顯差異(P>0.05)。在鹽處理的情況下，野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量均有所提高，鹽脅迫對(duì)苜蓿葉片中脯氨酸的影響顯著(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的脯氨酸量積累的多，說明rgMT轉(zhuǎn)化紫花苜蓿在鹽脅迫的條件下積累更多的脯氨酸來抵御外界不利的條件。

圖2 轉(zhuǎn)rgMT抗性植株的Northern blot鑒定Fig. 2 Northern blot identification of resistant plants transformed with the rgMT gene

WT: 非轉(zhuǎn)基因植株；#1～#8: 轉(zhuǎn)基因植株；下同。

WT: wild type plant；#1～#8: transgenic plants; similarly for the following figures.

圖3 逆境脅迫下野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株子葉期的生長(zhǎng)狀況Fig. 3 The performance of wild-type plants and transgenic plants under stress at the cotyledon stage

圖4 逆境脅迫下野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株幼苗期的生長(zhǎng)狀況Fig. 4 The performance of wild-type plants and transgenic plants under stress at the seedling stage

左：野生型植株；右：轉(zhuǎn)基因植株。

Left：Wild type plant; Right：Transgenic plant.

圖5 氯化鈉和碳酸氫鈉脅迫對(duì)苜蓿脯氨酸含量的影響Fig. 5 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the proline content in Medicago sativa

“*”表示轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間差異顯著(P<0.05),下同。

“*” indicate significant difference between wild type plant and transgenic plant under stress at the 0.05 level; similarly for the following figuers.

2.3.2鹽脅迫下苜蓿SOD活性檢測(cè) 在沒有逆境脅迫處理的情況下，野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性無明顯差異，在鹽脅迫下二者的SOD活性均有提高(圖6)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的SOD活性高，說明鹽處理?xiàng)l件下苜蓿體內(nèi)表達(dá)的rgMT基因?qū)俎ｓw內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性有一定的影響。

2.3.3鹽脅迫下苜蓿葉片相對(duì)質(zhì)膜透性分析 在沒有逆境脅迫條件下，野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株葉片中的相對(duì)電導(dǎo)率基本相同，即二者的細(xì)胞膜透性差異不顯著(P>0.05)，在鹽脅迫條件下，二者的相對(duì)電導(dǎo)率均迅速升高(P<0.05)，說明鹽處理對(duì)二者的細(xì)胞膜均有傷害，但轉(zhuǎn)基因植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率低于野生型植株，說明在NaCl和NaHCO3脅迫條件下，轉(zhuǎn)rgMT基因株系較非轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞膜具有較強(qiáng)的生理活性，即轉(zhuǎn)基因苜蓿的細(xì)胞膜在鹽脅迫下受到的傷害比非轉(zhuǎn)基因植株小(圖7)。

2.4 鹽脅迫下苜蓿H2O2含量變化

在脅迫條件下，植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧, 金屬硫蛋白基因具有清除活性氧的功能，植物中的活性氧含量的多少可以通過測(cè)量H2O2含量的多少來體現(xiàn)。在沒有鹽脅迫的條件下，野生型的苜蓿和轉(zhuǎn)基因苜蓿中的H2O2的含量沒有明顯的差異(P>0.05)，在鹽脅迫條件下，二者的H2O2含量均迅速升高(P<0.05)，但轉(zhuǎn)基因植株的H2O2含量明顯低于野生型植株，說明轉(zhuǎn)基因苜蓿中由于活性氧所帶來的對(duì)植物傷害要少于野生型苜蓿體內(nèi)的活性氧傷害(圖8)。

3 討論與結(jié)論

以往的研究報(bào)道表明，在早期對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行耐鹽篩選最為合適，因?yàn)樽匣ㄜ俎Ｔ诎l(fā)芽期和苗期對(duì)鹽分比較敏感[31]，鹽、堿脅迫與溫度交互作用對(duì)黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響研究發(fā)現(xiàn)，黃花苜蓿對(duì)堿性鹽和高pH有一定的耐受性[32]。紫花苜蓿苗期對(duì)鹽分反應(yīng)較發(fā)芽期更為敏感[33]，并且轉(zhuǎn)AtDREB2A基因的苜蓿在幼苗期受到NaHCO3脅迫后，明顯比未轉(zhuǎn)基因的苜蓿提高了耐堿性[34]，因此本研究選擇苜蓿生長(zhǎng)的苗期進(jìn)行植物的各種耐鹽堿性研究。

圖6 氯化鈉和碳酸氫鈉脅迫對(duì)苜蓿SOD活性的影響Fig. 6 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the SOD activity in Medicago sativa

圖7 氯化鈉和碳酸氫鈉脅迫脅迫對(duì)苜蓿葉片細(xì)胞膜透性的影響Fig. 7 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the relative membrane permeability in Medicago sativa leaves

圖8 氯化鈉和碳酸氫鈉脅迫對(duì)苜蓿H2O2含量的影響Fig. 8 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the H2O2 content in Medicago sativa

在本研究的各種逆境處理下，轉(zhuǎn)rgMT基因苜蓿的生長(zhǎng)要明顯優(yōu)于野生型，這說明水稻金屬硫蛋白rgMT基因在苜蓿中發(fā)揮了功能，從而提高了植物的抗逆性。植物的抗逆性是由多基因控制的數(shù)量性狀，植物對(duì)逆境耐性的強(qiáng)弱往往不取決于某一單個(gè)因子，其性狀受眾多因子的綜合影響。轉(zhuǎn)錄因子WRKY20基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)高鹽抵御能力增強(qiáng)，這是因?yàn)樵摶蛘{(diào)控其他基因的表達(dá)而改變苜蓿抵抗外界環(huán)境的能力[35]。蛋白激酶GsCRCK基因轉(zhuǎn)化的“農(nóng)菁1號(hào)”苜蓿在300和400 mmol·L-1NaCl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因苜蓿仍能正常生長(zhǎng)而野生型苜蓿則遭受嚴(yán)重鹽害，蛋白激酶是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)控作用的蛋白質(zhì)因子，尤其其單基因的表達(dá)就可以激活下游眾多功能基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，達(dá)到多個(gè)功能基因共同作用的效果[36]。金屬硫蛋白基因能夠提高植物的抗逆性，可能這個(gè)基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，在逆境條件下，不僅自身發(fā)揮功能，還能夠激發(fā)其他與逆境有關(guān)的基因表達(dá)，共同提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性。到底是rgMT基因在植物抗逆中起到主導(dǎo)作用，還是該基因激發(fā)其他基因的連鎖反應(yīng)進(jìn)而提高植物的抗逆境的能力，有待于進(jìn)一步的研究。

脯氨酸在正常情況下含量往往很低，在鹽脅迫等逆境條件下合成反應(yīng)被激活。有研究表明，植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量與植物的抗逆性呈正相關(guān)關(guān)系[37]，但也有研究報(bào)道，脯氨酸的積累與耐鹽程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[38]。本研究中轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片中的脯氨酸含量顯著高于對(duì)照，這與脯氨酸的積累與耐鹽程度呈正相關(guān)關(guān)系的報(bào)道相一致。

植物組織受到逆境傷害時(shí)，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，而使其透性增大。即細(xì)胞膜透性大小也能夠反映出細(xì)胞質(zhì)膜受害的程度[29]。本研究表明，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿和野生型苜蓿的細(xì)胞膜透性都在增大，但對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿細(xì)胞膜透性的影響明顯小于對(duì)非轉(zhuǎn)基因型苜蓿的影響。說明鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿的細(xì)胞受到的傷害較非轉(zhuǎn)基因型苜蓿小，即其抗鹽脅迫能力好于非轉(zhuǎn)基因苜蓿。

SOD是保護(hù)膜系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，在植物抗氧化脅迫中具有清除氧自由基、防止膜脂過氧化，維持活性氧代謝平衡的功能[39]。本研究表明，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿和野生型苜蓿的SOD含量都在增加，轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)SOD含量要高于野生型苜蓿SOD含量，說明轉(zhuǎn)基因苜蓿比野生型苜蓿具有更高的抗氧化能力。

活性氧發(fā)生在植物生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)階段，并且當(dāng)植物在生物和非生物逆境脅迫的條件下活性氧的濃度會(huì)升高，產(chǎn)生氧化脅迫。在100 mmol·L-1NaHCO3處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)野生大豆(Glycinesoja)GsGST19基因苜蓿株系生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗得黠@萎蔫、失綠，甚至死亡，與GsGST19基因具有過氧化物酶活性，能清除多余的活性氧有關(guān)[40]。有報(bào)道稱，金屬硫蛋白基因也與活性氧清除相關(guān)，能直接移走活性氧保護(hù)植物不受傷害[41-43]，將rgMT基因遺傳轉(zhuǎn)化到苜蓿體內(nèi)，也可能是由于rgMT基因的表達(dá)，有助于清除植物在逆境條件下產(chǎn)生的多余活性氧，從而提高了苜蓿的抗鹽堿能力。

本研究將rgMT基因轉(zhuǎn)入“農(nóng)菁1號(hào)”紫花苜蓿，獲得了7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，在NaCl和NaHCO3脅迫的情況下，轉(zhuǎn)基因苜蓿的生長(zhǎng)要好于野生型苜蓿，鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因苜蓿的脯氨酸含量和SOD活性均高于野生型，相對(duì)電導(dǎo)率低于野生型，轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)活性氧含量也明顯少于野生型苜蓿，表明rgMT基因在“農(nóng)菁1號(hào)”苜蓿中的過表達(dá)明顯提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性，有利于耐鹽堿苜蓿新品種的選育。

參考文獻(xiàn)References:

[1] 李善家,韓多紅,王恩軍,武燕.外源甜菜堿對(duì)鹽脅迫下黑果枸杞種子萌發(fā)和幼苗保護(hù)酶活性的影響.草業(yè)科學(xué),2016,33(4):674-680.

Li S J,Han D H,Wang E J,Wu Y.Effects of exogenous betaine on seed germination and antioxidase activities ofLyciumrutheniumseedlings under NaCl stress.Pratacultural Science,2016,33(4):674-680.(in Chinese)

[2] 王鑫,馬永祥,李娟.紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分及主要生物學(xué)特性.草業(yè)科學(xué),2003,20(10):39-41.

Wang X,Ma Y X,Li J.The nutrient content and major biological characters ofMadicagosativa.Pratacultural Science,2003,20(10):39-41.(in Chinese)

[3] Osborn T,Brouwer D,McCoy T.Molecular marker analysis of alfalfa.//McKersie B B D.(eds.).Biotechnology and the Improvement of Forage Legumes.Wallingford:CABI Publishing,1997:91-109.

[4] 姜健,楊寶靈,夏彤,于淑梅,烏云娜.紫花苜蓿耐鹽種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析.草業(yè)學(xué)報(bào),2011,20(5):119-125.

Jiang J,Yang B L,Xia T,Yu S M,Wu Y N.Analysis of genetic diversity of salt tolerant alfalfa germplasms.Acta Prataculturae Sinica,2011,20(5):119-125.(in Chinese)

[5] 張立全,張鳳英,哈斯阿古拉.紫花苜蓿耐鹽性研究進(jìn)展.草業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(6):296-305.

Zhang L Q,Zhang F Y,Hasiagula.Research progress on alfalfa salt tolerance.Acta Prataculturae Sinica,2012,21(6):296-305.(in Chinese)

[6] 劉艷芝,韋正乙,邢少辰,譚化,高明,董英山.HAL1基因轉(zhuǎn)化苜蓿再生植株及其耐鹽性.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,33(6):21-24.

Liu Y Z,Wei Z Y,Xing S C,Tan H,Gao M,Dong Y S.Transgenetic alfalfa withHAL1 gene and its salt tolerance.Journal of Jilin Agricultural Sciences,2008,33(6):21-24.(in Chinese)

[7] 侯建建,白春生,張慶,玉柱.單一和復(fù)合乳酸菌添加水平對(duì)苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及蛋白組分的影響.草業(yè)科學(xué),2016,33(10):2119-2125.

Hou J J,Bai C S,Zhang Q,Yuzhu.Effects of different additive amount of single and multiplel actic acid bacteriaon the silage quality and protein fractions of alfalfa.Pratacultural Science,2016,33(10):2119-2125.(in Chinese)

[8] 李波,趙洪波,楊蔚然,李紅.NaHCO3脅迫對(duì)苜蓿苗期適應(yīng)性的影響.種子,2010,29(2):22-25.

Li B,Zhao H B,Yang W R,Li H.Effect of adaptive capacity of alfalfa seedlings to NaHCO3stress.Seed,2010,29(2):22-25.(in Chinese)

[9] Deak M,Kiss G B,Koncz C,Dudits D.Transformation ofMedicagoby agrobacterium mediated gene transfer.Plant Cell Report,1986,5(2):97-100.

[10] Bao A K,Wang S M,Wu G Q,Xi J J,Zhang J L,Wang C M.Over expression of the arabidopsis H+-ppase enhanced resistance to salt and drought stress in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.).Plant Science,2009,176(2):232-240.

[11] Verdoy D,De La Pena T C,Redondo F J,Lucas M M,Pueyo J J.TransgenicMedicagotruncatulaplants that accumulate proline display nitrogen-fixing activity with enhanced tolerance to osmotic stress.Plant Cell and Environment,2006,29(10):1913-1923.

[12] Liu L,Fan X D,Wang F W,Wang N,Dong Y Y,Liu X M,Yang J,Wang Y F,Li H Y.Coexpression ofscnhx1 andscvpin transgenic hybrids improves salt and saline-alkali tolerance in alfalfa (MedicagosativaL.).Journal of Plant Growth Regulation,2013,32(1):1-8.

[13] Wang Z Y,Song F B,Cai H,Zhu Y M,Bai X,Ji W,Li Y,Hua Y.Over-expressinggsgst14 fromGlycinesojaenhances alkaline tolerance of transgenicMedicagosativa.Biologia Plantarum,2012,56(3):516-520.

[14] Li W F,Wang D L,Jin T C,Chang Q,Yin D X,Xu S M,Liu B,Liu L X.The vacuolar Na+/H+antiporter genessnhx1 from the halophyteSalsolasodaconfers salt tolerance in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.).Plant Molecular Biology Reporter,2011,29(2):278-290.

[15] Zhang Y M,Zhang H M,Liu Z H,Li H C,Guo X L,Li G A.The wheat nhx antiporter genetanhx2 confers salt tolerance in transgenic alfalfa by increasing the retention capacity of intracellular potassium.Plant Molecular Biology,2015,87(3):317-327.

[16] 代勛,龔明.植物金屬硫蛋白在植物抗逆性中的作用.寧夏師范學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(3):47-51.

Dai X,Gong M.The function of plant metallothioneins in plant resistence.Journal of Ningxia Teachers University (Natural Science),2011,32(3):47-51.(in Chinese)

[17] Margoshes M,Vallee B L.A cadmium protein from equine imaging hyperintensity in Alzheimer’s disease:Correlation with kidney cortex.Journal of American Chemical Society,1957,79:4813-4814.

[18] Cobbett C,Goldsbrough P.Phytochelatins and metallothioneins:Roles in heavy metal detoxification and homeostasis.Annual Review of Plant Biology,2002,53:159-182.

[19] Yang M X,Zhang F,Wang F,Dong Z G,Cao Q F,Chen M C.Characterization of a type 1 metallothionein gene from the stresses-tolerant PplantZiziphusjujuba.International Journal of Molecular Sciences,2015,16(8):16750-16762.

[20] Kawasaki S,Borchert C,Deyholos M,Wang H,Brazille S,Kawai K,Galbraith D,Bohnert H.Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice.The Plant Cell,2001,13(4):889-905.

[21] Oztur Z N,Talame V,Deyholos M,Michalowski C,Galbraith D,Gozukirmizi N,Tuberosa R,Bohnert H.Monitoring large-scale changes in transcript abundance in drought- and salt-stressed barley.Plant Molecular Biology,2002,48(5-6):551-573.

[22] Nishiuchi S,Liu S,Takano T.Isolation and characterization of a metallothionein-1 protein inChlorisvirgataswartz that enhances stress tolerances to oxidative,salinity and carbonate stress inSaccharomycescerevisiaei.Biotechnology Letters,2007,29(8):1301-1305.

[23] Zhang M,Takano T,Liu S K,Zhang X X.Abiotic stress response in yeast and metal-binding ability of a type 2 metallothionein-like protein (putmt2) fromPuccinelliatenuiflora.Molecular Biology Reports,2014,41(9):5839-5849.

[24] 金淑梅,孫丹,王吉.堿蓬金屬硫蛋白基因?qū)μ妓猁}脅迫的應(yīng)答.草業(yè)科學(xué),2014,31(11):2082-2087.

Jin S M,Sun D,Wang J.Metallothionein gene (sgMT) fromSuaedaglaucaexpression under saline stress.Pratacultural Science,2014,31(11):2082-2087.(in Chinese)

[25] Jin S M,Sun D,Wang J,Li Y,Wang X W,Liu S K.Expression of thergMTgene,encoding for a rice metallothionein-like protein inSaccharomycescerevisiaeandArabidopsisthaliana.Journal of Genetics,2014,93(3):709-718.

[26] 張?jiān)聦W(xué),唐鳳蘭,張弘強(qiáng),韓微波,李道明,劉杰淋,蒿若超,申忠寶,劉錄祥.零磁空間處理選育紫花苜蓿品種農(nóng)菁1號(hào).核農(nóng)學(xué)報(bào),2006,21(1):34-37.

Zhang Y X,Tang F L,Zhang H Q,Han W B,Li D M,Liu J L,Song R C,Shen Z B,Liu L X.Breeding of new variety Nongjing No.1 ofMedicagosativaL. by magnetic field free space.Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2006,21(1):34-37.(in Chinese)

[27] 金淑梅,管清杰,羅秋香,王濤,高野哲夫,柳參奎.苜蓿愈傷組織高頻再生遺傳和轉(zhuǎn)化體系的建立.分子植物育種,2006,4(4):571-578.

Jin S M,Guan Q J,Luo Q X,Wang T,Tetsuo T,Liu S K.Study on high frequency regeneration and transformation system of alfalfa from embryogenic callus.Molecular Plant Breeding,2006,4(4):571-578. (in Chinese)

[28] Sambrook J F,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

[29] 張治安,張美善,蔚榮海.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2004.

Zhang Z A,Zhang M S,Wei R H.Instructional on Plant Physiology.Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,2004.(in Chinese)

[30] 鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.

Zhou Q.Instructional on Plant Physiology.Beijing:China Agriculture Press,2000.(in Chinese)

[31] Li R L,Shi F C,Fukuda K,Yang Y L.Effects of salt and alkali stresses on germination,growth,photosynthesis and ion accumulation in alfalfa (MedicagosativaL.).Soil Science and Plant Nutrition,2010,56(5):725-733.

[32] 武祎,田雨,張紅香,楊健,吳志紅.鹽堿脅迫與溫度對(duì)黃花苜蓿種子發(fā)芽的影響.草業(yè)科學(xué),2015,32(11):1847-1853.

Wu Y,Tian Y,Zhang H X,Yang J,Wu Z H.Effects of salinity,alkalinity,temperature and their interactions on seed germination ofMedicagofalcata.Pratacultural Science,2015,32(11):1847-1853.(in Chinese)

[33] 于卓,孫祥,張文忠,鄭淑霞.苜蓿品種間種子萌發(fā)及苗期耐鹽性差異的研究.干旱區(qū)資源與環(huán)境,1993,7(2):106-111.

Yu Z,Sun X,Zhang W Z,Zheng S X.Studies on the differences of salt tolerence between seed germination and seedling of alfalfa cultivars.Journal of Arid Land Resources and Environment,1993,7(2):106-111.(in Chinese)

[34] 才華,宋婷婷,張大洋.Rd29a和camv-35s啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)atdreb2a苜蓿耐堿性分析.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(9):16-23.

Cai H,Song T T,Zhang D Y.Alkaline tolerance analysis of transgenic alfalfa withatdreb2agene regulated by Rd29A and camv-35s promoter.Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(9):16-23.

[35] Tang L L,Cai H,Zhai H,Luo X,Wang Z Y,Cui L,Bai X.Overexpression ofGlycinesojawrky20 enhances both drought and salt tolerance in transgenic alfalfa (Medicagosativa).Plant Cell Tissue and Organ Culture,2014,118(1):77-86.

[36] 劉瑩,才華,劉晶,柏錫,紀(jì)巍,朱延明.Gscrck基因轉(zhuǎn)化農(nóng)菁1號(hào)苜蓿及其耐鹽性分析.草業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(2):150-157.

Liu Y,Cai H,Liu J,Bai X,Ji W,Zhu Y M.Transformation of theGscrckgene intoMedicagosativacv. Nongjing No.1 and salt tolerance analysis in transgenic plants.Acta Prataculturae Sinica,2013,22(2):150-157.(in Chinese)

[37] 秦峰梅,張紅香,武祎,周道瑋.鹽脅迫對(duì)黃花苜蓿發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響.草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(4):71-78.

Qing H F,Zhang H X,Wu W,Zhou D W.Effects of salt stress on germination and seedling growth ofMedicagofalcata.Acta Prataculturae Sinica,2010,19(4):71-78.(in Chinese)

[38] Petrusal M W L.Proline status in salt-tolerant and salt-sensitive alfalfa cell lines and plants in response to nacl.Plant Physiology Biochemistry,1997,35(4):303-310.

[39] 張永峰,殷波.混合鹽堿脅迫對(duì)苗期紫花苜?？寡趸富钚约氨┖康挠绊?草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(1):46-50.

Zhang Y F,Yin B.Influences of salt and alkali mixed stresses on antioxidative activity and MDA content ofMedicagosativaat seedling stage.Acta Prataculturae Sinica,2009,18(1):46-50.(in Chinese)

[40] 王臻昱,才華,柏錫,紀(jì)巍,李勇,魏正巍,朱延明.野生大豆GsGST19基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽堿性分析.作物學(xué)報(bào),2012,38(6):971-979.

Wang Z Y,Cai H,Bai X,Ji W,Li Y,Wei Z W,Zhu Y M.Isolation ofGsGST19 fromGlycinesojaand analysis of saline-alkaline tolerance for transgenicMedicagosativa.Acta Agronomica Sinica,2012,38(6):971-979.(in Chinese)

[41] Xiong L, Schumaker K S,Zhu J K.Cell signaling during cold,drought,and salt stress.Plant Cell,2002,14:165-183.

[42] Wong H L,Sakamoto T,Kawasaki T,Umemura K,Shimamoto K.Down-regulation of metallothionein,a reactive oxygen scavenger,by the small gtpase osrac1 in rice.Plant Physiology,2004,135(3):1447-1456.

[43] Nzengue Y,Steiman R,Rachidi W,Favier A,Guiraud P.Oxidative stress induced by cadmium in the c6 cell line:Role of copper and zinc.Biological Trace Element Research,2012,146(3):410-419.