抗生素-重金屬雙抗菌篩選及抗性研究

楊統(tǒng)一,盛冬雯,巢 波,楊 芬,姚志宇,唐玉斌

(江蘇科技大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,鎮(zhèn)江 212018)

在后抗生素時代,日漸增多的抗生素抗性菌嚴(yán)重威脅人類健康,全球面臨抗生素失效的風(fēng)險．土壤作為環(huán)境中最重要的抗性菌的儲庫之一,在研究中備受重視．現(xiàn)有研究表明抗生素并不是驅(qū)動土壤中抗生素抗性基因及水平轉(zhuǎn)移的唯一因素,一些非抗生素物質(zhì),特別是重金屬也能間接激發(fā)微生物抗生素抗性[1-2]．

近年來,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的多種種植措施,如大量使用含有多種抗生素殘留和重金屬元素(Cu、Zn等)的畜禽糞肥、重金屬營養(yǎng)劑及抗生素類抑菌劑噴施,都加劇了農(nóng)田土壤重金屬和抗生素的復(fù)合污染[3]．與抗生素的環(huán)境行為不同, 進入土壤中的重金屬很難被降解, 作為一種廣泛且頑固的選擇性壓力長期存在, 而可能通過協(xié)同作用進一步加劇微生物抗生素抗性．重金屬與抗生素協(xié)同選擇壓力使環(huán)境中抗生素抗性微生物種群增加,形成新一代的抗性菌群[4-5],攜帶抗生素抗性基因的菌群在土壤中轉(zhuǎn)移、傳播和擴散,并使抗性種群在競爭中逐漸成為優(yōu)勢群落,從而改變自然微生物群落結(jié)構(gòu),這將極大地危害人類健康及土壤微生物的生態(tài)效應(yīng)．

微生物修復(fù)被廣泛用于水體和土壤污染,它是利用微生物對環(huán)境污染物的代謝作用而轉(zhuǎn)化、降解污染物．通常采用促進土著微生物的代謝活性,從環(huán)境中分離、篩選降解菌及投加微生物和微生物制劑等方式[6-7]．盡管抗生素具有抑菌和殺菌作用,環(huán)境中還是可能存在一些兼具耐藥性和降解功能的專性降解菌,這些微生物菌株的分離和鑒定將有助于推動抗生素及其復(fù)合污染生物修復(fù)技術(shù)的開發(fā)與研究[8-9]．本試驗從重金屬銅離子處理的土壤中篩選出抗生素與重金屬交叉抗性菌株,通過研究Cu2+對抗生素抗性菌抗性的影響,以此為重金屬和抗生素交叉污染環(huán)境的修復(fù)治理提供科學(xué)依據(jù)和借鑒．

1 實驗

1.1 土樣的采集與處理

土壤樣品采集于2015年3月江蘇科技大學(xué)西校區(qū)蠶業(yè)研究所桑園苗圃,按5點取樣法采樣,然后將收集到的所有土壤混勻,保存于-20℃冰箱．

1.2 抗生素溶液的配制

抗生素儲備液使用滅菌的超純水配制．采用0.22 μm水相濾膜將儲備液過濾除菌,避光保存于-20℃冰箱,保存時間不超過一周．

1.3 培養(yǎng)基的制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 000 ml,瓊脂20 g,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4．

抗生素培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min,冷卻至50 ℃左右時,向其中添加抗生素儲備液,使慶大霉素和鏈霉素的終濃度為32 mg/L,新霉素濃度為128 mg/L,青霉素、磺胺噻唑和頭孢霉素的濃度為64 mg/L．

藥敏試驗培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌冷卻至50℃左右時,向其中添加CuSO4儲備液使Cu2+終濃度分別至0,25,50,75 mg/L．

1.4 土壤抗生素抗性菌的分離純化

將土壤樣品用滅菌的生理鹽水制備成土壤懸液,經(jīng)梯度稀釋后,取100 μL均勻涂布于添加有相應(yīng)抗生素的滅菌培養(yǎng)基平板上,每個土樣3個平行,30 ℃培養(yǎng)48 h．挑取平板上的單菌落進行劃線分離純化,所用培養(yǎng)基仍為添加相應(yīng)濃度的抗生素培養(yǎng)基．

1.5 生理生化鑒定

菌株的生理生化鑒定參照文獻(xiàn)[10]進行,包括過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、淀粉水解實驗、糖醇發(fā)酵實驗、產(chǎn)生吲哚實驗、甲基紅實驗、檸檬酸鹽的利用實驗、V.P.實驗、苯丙氨酸脫氫酶實驗、硫化氫產(chǎn)氣實驗和革蘭氏染色實驗．

1.6 細(xì)菌的分子鑒定

基因組DNA的提取[11]:取一環(huán)單菌落于5 mL滅菌的LB培養(yǎng)基中,30 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng)過夜．取1.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液12 000 r/min離心2 min,棄上清,收集菌體;菌體中加500 μL無菌去離子水,-20 ℃冷凍一段時間后,100 ℃水浴5 min;渦旋30 s;重新冷凍,水浴,渦旋一次,12 000 r/min離心5 min,取上清,即為DNA模板,-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

引物27-F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’和1492-R:5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’為16S rDNA上下游引物,擴增分離的細(xì)菌DNA[10, 12]．測序結(jié)果提交GenBank,后用Blast軟件將測序結(jié)果與GenBank中已知菌株的16S rDNA序列進行同源性比較,選取同源性較高的序列,利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.7 抗性菌株的交叉耐藥性測試

1.7.1 不同濃度Cu2+對抗性菌株生長的影響

挑取純化后的抗性菌株S-2于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng)過夜．取該菌液1 mL接種于100 ml滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,并向液體培養(yǎng)基中添加Cu2+使其終濃度分別為0,50,100,200 mg/L,30 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng),每間隔幾小時進行取樣,測定600 nm時的OD值[13]．

1.7.2 藥敏實驗

參考文獻(xiàn)[14],先配好添加了0,25,50 mg/L的不同銅離子濃度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,然后取抗性菌懸液涂布在添加了分別浸泡過磺胺噻唑、頭孢拉定、鏈霉素、青霉素、慶大霉素、新霉素以及氨芐霉素的濾紙的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,最后將其放置在恒溫30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.7.3 不同濃度Cu2+對菌株抗生素抗性能力的影響

取1 mL活化后的S-2菌液接種于100 mL滅菌冷卻至室溫的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,并添加鏈霉素、青霉素鈉和磺胺噻唑,使終濃度分別為32、64和64 mg/L,同時添加Cu2+使其終濃度分別為0,50,100,200 mg/L,每個交叉抗性試驗設(shè)置3個重復(fù),30℃,120 r/min搖床培養(yǎng),定時取樣,測定OD600值．

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 抗性菌株的鑒定

2.1.1 菌株生理生化特征

由圖1和表1可知,S-2菌為革蘭氏陽性菌,菌落為白色,不規(guī)則狀,無光澤,邊緣有鋸齒,不透明,表面濕潤平滑．生理生化鑒定表明該菌過氧化氫酶、淀粉水解、苯丙氨酸脫氫酶、硝酸鹽還原、甲基紅、硫化氫和吲哚實驗呈陽性,而乳糖發(fā)酵、葡萄糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵和V.P.實驗呈陰性．

圖1 菌株S-2菌落形態(tài)Fig.1 Colony of strain S-2表1 S-2菌株的生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemicalidentification of strain S-2

鑒定項目S-2鑒定項目S-2乳糖發(fā)酵-硝酸鹽還原+葡萄糖發(fā)酵-甲基紅+甘露醇發(fā)酵-V.P.-過氧化氫酶+硫化氫+淀粉水解+吲哚+苯丙氨酸脫氫酶+革蘭氏染色+

注:“+” 陽性;“-” 陰性

2.1.2 基于16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將體外擴增的細(xì)菌16S rDNA 基因擴增產(chǎn)物進行測序后,序列提交GenBank,獲得登錄號KT283097．利用Blast進行序列同源性分析,結(jié)果表明菌株S-2與Streptomyces sp.ABF2(KX010118.1)具有86%的相似性,在 NCBI 中選取與菌株S-2親緣關(guān)系較近的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)．

圖2 菌株S-2的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNAgene sequences of strain S-2

2.2 Cu2+對抗性菌生長周期的影響

圖3 不同濃度Cu2+對抗性菌株生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Cu2+on the growth of strain S-2

由圖3可知,在Cu2+濃度為0時,菌株S-2均在6 h左右開始進入對數(shù)生長期,40 h左右生長速度減慢,開始逐步進入穩(wěn)定期．Cu2+濃度為50，100 mg/L時,對S-2對數(shù)期影響不大,對穩(wěn)定期的菌體濃度影響較大;當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到200 mg/L時,S-2對數(shù)期表現(xiàn)不明顯,菌體濃度一直緩慢增加,140 h后生長速度有加快趨勢．綜合來說菌株的生長是受到了Cu2+的抑制,且抑制程度隨Cu2+濃度的增加而逐漸增強．但菌株S-2在經(jīng)過一定時間的調(diào)整適應(yīng)后仍能夠進行正常的生長繁殖,進入穩(wěn)定期,說明對Cu2+還是有一定抗性的．文獻(xiàn)[15]在重金屬銅的土壤微生物毒性研究中發(fā)現(xiàn)低濃度銅對土壤微生物量有顯著刺激作用,高濃度時則有抑制作用,與本實驗結(jié)果相似．

2.3 抗性菌株對七種抗生素的藥敏實驗

抗性菌的藥敏試驗紙片法的抑菌范圍參考標(biāo)準(zhǔn)見表2,試驗結(jié)果見表3．

表2 藥敏試驗參考標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Reference standard of Susceptibility testing

由表2和3可知,沒有Cu2+離子存在時,菌株S-2對青霉素鈉和磺胺噻唑敏感,而對其他5種抗生素均為耐藥．當(dāng)Cu2+濃度為25 mg/L時,磺胺噻唑和青霉素試紙周圍抑菌圈增大,說明隨著銅離子濃度的升高,銅離子與磺胺噻唑和青霉素鈉共存時為協(xié)同殺菌作用[16-17]．當(dāng)Cu2+濃度為50 mg/L時,抑制了S-2的生長,但鏈霉素S周圍仍可長出少量菌落,表明S-2菌株對鏈霉素與50 mg/L銅離子具有交叉抗性．

表3 菌株S-2藥敏試驗結(jié)果Table 3 Antibiotics sensitive tests of strainS-2 Drug sensitive test

注:R表示耐藥,I表示中介,S表示敏感

2.4 Cu2+對菌株抗生素抗性的影響

圖4 不同Cu2+濃度和鏈霉素對S-2菌株的影響Fig.4 Effect of streptomycin and different concentrationsof Cu2+ on growth of strain S-2

由圖4可知,鏈霉素與不同濃度的Cu2+共存時,抗性菌S-2的適應(yīng)期延長,且Cu2+濃度越大,S-2的適應(yīng)期也越長,說明抗性菌S-2的生長受到的抑制作用與Cu2+的濃度有關(guān)．但經(jīng)過較長的適應(yīng)期后,抗性菌S-2仍能繼續(xù)生長繁殖,說明S-2具有鏈霉素和Cu2+的交叉抗性,這與藥敏試驗的結(jié)果一致．S-2隨Cu2+濃度的增大受到的抑制作用逐漸增強,說明Cu2+與鏈霉素之間表現(xiàn)為協(xié)同殺菌．

圖5 不同Cu2+濃度和青霉素鈉對S-2菌株的影響Fig.5 Effect of penicillin sodium and differentconcentrations of Cu2+ on growth of strain S-2

由圖5可知,青霉素鈉與不同濃度的Cu2+共存時,抗性菌S-2的生長與鏈霉素和Cu2+共存時的結(jié)果類似,但Cu2+濃度在0～200 mg/L范圍時,對抗性菌S-2影響較小,說明S-2具有青霉素和Cu2+的交叉抗性,且抗性較強．

圖6 不同Cu2+濃度和磺胺噻唑?qū)-2菌株的影響Fig.6 Effect of sulfathiazole and different concentrationsof Cu2+ on growth of strain S-2

由圖6可知,磺胺噻唑與不同濃度的Cu2+共存時,抗性菌S-2的生長與鏈霉素和Cu2+共存時的結(jié)果類似,說明S-2具有磺胺噻唑和Cu2+的交叉抗性．S-2隨Cu2+濃度的增大受到的抑制作用逐漸增強,說明Cu2+與磺胺噻唑之間表現(xiàn)為協(xié)同殺菌．文獻(xiàn)[13]發(fā)現(xiàn)的低濃度重金屬Cr6+或Zn2+和紅霉素,Cu2+與頭孢拉定共存時表現(xiàn)為協(xié)同抗性,高濃度為協(xié)同殺菌,可能與抗生素的種類以及細(xì)菌種類有關(guān)．

3 結(jié)論

(1) 綜合抗性菌的生理生化特性及分子生物學(xué)分析,可初步鑒定菌株S-2與鏈霉菌(Stereptomyces)具有86%相似性;

(2) 抗性菌株S-2的生長會受到銅離子濃度的影響,但同時又對銅離子表現(xiàn)出一定的抗性;

(3) 藥敏實驗結(jié)果表明抗性菌株S-2具有多重耐藥性,能夠耐受鏈霉素、頭孢拉定、慶大霉素、新霉素及氨芐霉素;

(4) 交叉抗性表明,抗性菌株S-2具有鏈霉素和Cu2+的交叉抗性,青霉素鈉和Cu2+的交叉抗性及磺胺噻唑和Cu2+的交叉抗性．

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