NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗光合特征及抗性的影響

趙穎，弋欽，魏小紅，辛夏青，韓廳，岳凱，王方琳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科草本植物，在草地畜牧業(yè)生產(chǎn)中的地位無可替代，在實(shí)際生產(chǎn)中干旱已成為苜蓿高產(chǎn)的主要限制性因素之一。干旱引起的滲透脅迫直接導(dǎo)致光合作用的原料水的缺乏，植物通過關(guān)閉氣孔減少蒸騰作用，阻礙CO2進(jìn)入葉片，嚴(yán)重時(shí)甚至使光合機(jī)構(gòu)受損，光合面積擴(kuò)展受抑，光合色素的合成受阻而分解加強(qiáng)[1-2]。此外，干旱環(huán)境還會(huì)損傷植物細(xì)胞、組織及器官，如氧化損傷使植物新陳代謝發(fā)生紊亂[3]。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是植物體內(nèi)一種重要的生物活性分子，主要由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)催化合成[4]，參與植物的呼吸作用、光形態(tài)發(fā)生、根和葉的發(fā)育、延緩衰老等生理過程[5-6]。Ca2+作為偶聯(lián)胞外信號(hào)與胞內(nèi)生理生化的信號(hào)載體，通過鈣調(diào)素、鈣依賴蛋白激酶和膜聯(lián)蛋白增強(qiáng)植物生理系統(tǒng)功能[7-8]。研究表明，NO通過活化鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase, GC)升高細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine, cGMP)水平，從而促進(jìn)環(huán)式ADP-核糖與細(xì)胞內(nèi)Ca2+通道結(jié)合活化Ca2+釋放機(jī)制，使得細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高[9-10]。因此，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，NO作為胞內(nèi)和胞間信號(hào)分子，還會(huì)參與基因與蛋白的表達(dá)和植物對逆境脅迫的生理應(yīng)答過程[11]。而亞甲基藍(lán)(methylene blue, MB)是GC和NOS的強(qiáng)效抑制劑[12]，可使cGMP含量降低[13]，從而抑制NO的調(diào)控作用。植物體NOS的活性需要Ca2+作為輔助因子[14]，外施SNP 可提高胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度來控制氣孔的開閉降低蒸騰作用[15]，提升抗氧化酶活性緩解氧化損傷[16]。植物應(yīng)對非生物脅迫中NO與Ca2+存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，已有研究表明，干旱脅迫下，Ca2+參與NO誘導(dǎo)水稻(Oryzasativa)不定根的形成[17]，促進(jìn)苜蓿種子萌發(fā)[18]。

已知低濃度的NO能夠緩解非生物脅迫下紫花苜蓿幼苗的氧化損傷，但NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗光合作用和抗氧化能力的影響及其與Ca2+信號(hào)之間的關(guān)系尚不清楚。為此，本試驗(yàn)利用SNP、CaCl2、LaCl3及MB溶液處理滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗，通過對其葉片光合色素組成、光合作用參數(shù)、抗氧化酶活性及MDA、脯氨酸含量的測定，以探討NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)在提升紫花苜蓿幼苗抗旱能力中的作用，為干旱環(huán)境下紫花苜蓿的種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)于2015年6-9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試紫花苜蓿品種‘阿爾岡金’(M.sativacv. Algonquin)購于甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子公司。

選取顆粒飽滿、無病蟲害的紫花苜蓿種子消毒、催芽后挑選露白一致的種子播種在裝有等量營養(yǎng)土的花盆中(口徑12 cm)，在(25±1) ℃，14 h光照/10 h黑暗恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000 lx，每隔2 d使用稱重法補(bǔ)充水分，培養(yǎng)50 d后每盆保留20株生長一致且健康的苜蓿植株。分別量取40 mL蒸餾水、SNP、CaCl2、SNP+CaCl2、SNP+LaCl3、CaCl2+MB(兩種處理液比例為1∶1)處理液噴施于葉面進(jìn)行預(yù)處理，每24 h噴施1次，連續(xù)噴施3次。然后在土壤中澆40 mL 15% PEG-6000進(jìn)行滲透脅迫處理，每天澆1次，連續(xù)處理6 d，對照加等量蒸餾水。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：CK：蒸餾水；PEG：15% PEG；SNP+PEG：0.1 mmol/L SNP+15% PEG；CaCl2+PEG：10 mmol/L CaCl2+15% PEG；SNP+CaCl2+PEG：0.1 mmol/L SNP+10 mmol/L CaCl2+15% PEG；SNP+LaCl3+PEG：0.1 mmol/L SNP+10 μmol/L LaCl3+15% PEG；CaCl2+MB+PEG：10 mmol/L CaCl2+5 μmol/L MB+15% PEG，每組處理重復(fù)3次。在脅迫前(0 d)和脅迫后第2，4，6天取幼苗葉片測定光合色素、光合氣體交換參數(shù)、MDA、脯氨酸含量以及抗氧化酶活性并做POD同工酶電泳，測定重復(fù)3次。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1葉綠素含量的測定 參照鄒琦[19]的分光光度法。

1.2.2光合氣體交換參數(shù)的測定 采用CI-340 手持式光合作用測量系統(tǒng)在9:00-11:00(晴天)測定幼苗倒數(shù)第2～3片功能葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)。氣孔限制值Ls=1-Ci/Ca(Ca為大氣中CO2濃度)。

1.2.3生理指標(biāo)測定 丙二醛(malonaldehyde，MDA)、脯氨酸含量測量參照劉文瑜等[20]方法，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)采用NBT顯色法測定[21]；過氧化物酶(peroxide，POD)采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定[22]；過氧化氫酶(Catalase，CAT)采用紫外吸收法測定[23]。

1.2.4POD同工酶分析 采用不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳；染色采用改良的聯(lián)苯胺染色法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)最少設(shè)定3個(gè)重復(fù)，采用Microsoft Excel 2010整理分析數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

圖1 外源NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素含量變化的影響Fig.1 Effects of exogenous nitric oxide and Ca2+ on chlorophyll content of alfalfa seedling leaves under osmotic stress

2.1 外源NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗光合色素的影響

光合色素參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換從而影響植物光合作用。如圖1所示，與脅迫前(0 d)相比，滲透脅迫第4天各處理葉綠素含量降低，CK處理葉綠素含量比脅迫前葉綠素含量增加了8.68%。第4天時(shí)，15% PEG處理下的紫花苜蓿幼苗葉綠素含量與CK相比下降了42.8%，外源施加NO供體SNP和Ca2+信號(hào)試劑CaCl2均能夠有效緩解滲透脅迫引起的葉綠素含量的降低，其中，SNP+PEG、CaCl2+PEG和SNP+CaCl2+PEG處理下葉綠素含量較單一PEG處理分別提高了30.26%，31.80%和40.81%。施加抑制劑LaCl3或MB抑制了該緩解作用，SNP+LaCl3+PEG處理與SNP+PEG、PEG處理相比葉綠素含量分別降低了33.8%和13.80%， CaCl2+MB+PEG處理與CaCl2+PEG、PEG處理相比葉綠素含量分別下降了40.03%和20.97%。說明滲透脅迫下阻斷Ca2+信號(hào)通道或者抑制NO信號(hào)通路的傳導(dǎo)均會(huì)使紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素的合成受阻。

由表1可知，滲透脅迫前，SNP、CaCl2、SNP+CaCl2處理下紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素b(chl b)含量顯著高于CK，分別比CK增加了33.18%，31.17%和54.04%，而對應(yīng)相同處理下紫花苜蓿葉片葉綠素a(chl a)含量卻顯著低于CK，分別比CK降低了3.99%，4.38%和3.60%。滲透脅迫第4天紫花苜蓿幼苗葉片光合色素組分含量均降低，PEG處理chl a和chl b含量分別比對照組降低了43.46%和41.97%，類胡蘿卜素增加了52.50%。滲透脅迫下施加SNP、CaCl2或SNP+CaCl2后chl a含量分別比PEG處理下提高了49.55%，47.92%和63.11%，chl b含量分別提高了8.40%，13.52%和15.36%。說明滲透脅迫下同時(shí)施加SNP+CaCl2比單一噴施SNP或CaCl2處理更有利于葉片葉綠素的合成。

表1 外源NO及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿葉片光合色素含量影響Table 1 Effects of exogenous nitric oxide and Ca2+ on photosynthetic pigment contents of alfalfa seedling leaves under osmotic stress (mg·L-1)

2.2 外源NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片光合作用參數(shù)的影響

由表2可知，PEG處理下紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和氣孔限制值(Ls)顯著低于對照，而胞間CO2濃度(Ci)顯著升高(P<0.05)。外源噴施SNP、CaCl2及SNP+CaCl2均抑制了PEG脅迫下Pn、Gs和Ls的降低及Ci的升高。SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理與PEG處理比較，Pn分別提高了42.42%，52.52%和81.82%，Gs分別提高了42.11%，52.63%和70.18%，Ci分別降低了11.42%，13.76%和18.07%。SNP+LaCl3與SNP處理相比葉片Pn、Gs、Ls分別降低了51.06%、40.74%、75.00%，Ci升高了11.21%；而CaCl2+MB與CaCl2處理相比Pn、Gs、Ls分別降低了40.00%，40.23%，46.67%，Ci提升了8.03%。SNP+LaCl3和CaCl2+MB處理均使Pn、Gs和Ls值減小，Ci增加。如表3所列，對紫花苜蓿幼苗光合參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，Pn與Gs、Ls存在極顯著的相關(guān)性(P<0.01)，Gs與Ci、Gs與Ls及Ci與Ls間也存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)，而Pn與Ci之間呈顯著相關(guān)(P<0.05)。

2.3 外源NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

2.3.1外源NO和Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗SOD活性的影響 從圖2可以看出，SOD活性隨著滲透脅迫時(shí)間的延長而升高，CK變化平緩，在第6天時(shí)各處理SOD活性均達(dá)到最大值，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理下SOD活性均顯著高于PEG處理。第2天時(shí)，各處理間差異顯著(P<0.05)，其中施加SNP、CaCl2及SNP+CaCl2與PEG處理相比SOD活性分別提高了16.13%，30.17%和46.74%；SNP+LaCl3和CaCl2+MB處理與PEG處理相比SOD活性降低了7.09%和23.26%。第6天時(shí)，SNP、CaCl2、SNP+CaCl2、SNP+LaCl3和CaCl2+MB處理分別比15%PEG處理時(shí)SOD活性增加了29.10%，24.17%，39.29%，11.95%和3.10%。說明SNP可能通過促進(jìn)Ca2+含量的增加對植物滲透脅迫進(jìn)行生理調(diào)控，當(dāng)Ca2+通道被阻斷時(shí)，外源NO供體SNP可通過非依賴cGMP途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，而NO信號(hào)通路被抑制，Ca2+信號(hào)單獨(dú)作用時(shí)對SOD活性的增強(qiáng)效果較弱。

表2 外源NO及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿葉片光合氣體交換參數(shù)的影響Table 2 Effects of exogenous nitric oxide and Ca2+ on photosynthetic gas exchange parameters in leaves of alfalfa seedlings under osmotic stress

表3 外源NO及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿光合交換參數(shù)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of photosynthetic parameters in alfalfa under exogenous nitric oxide and Ca2+ treatment

2.3.2外源NO和Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗POD活性的影響 如圖3所示，POD活性隨著滲透脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，第4天時(shí)各處理SOD活性達(dá)到最大值，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理均能顯著提高滲透脅迫下POD活性。第0和2天時(shí)，SNP、CaCl2和共處理間差異不顯著。第4天時(shí)，施加SNP或CaCl2促進(jìn)了POD活性的增加，其中SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理較PEG處理POD活性分別增加了11.19%，19.94%和30.41%，而添加抑制劑LaCl3和MB后降低了葉片POD活性，分別比PEG處理減少了2.41%和3.71%。

2.3.3外源NO和Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗CAT活性的影響 由圖4可知，CAT活性隨著滲透脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，CK處理下酶活性變化相對平緩。滲透脅迫第4天時(shí)各處理CAT活性均達(dá)到最大值，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理比PEG處理紫花苜蓿幼苗葉片CAT活性分別增加了36.62%，49.70%和56.24%。SNP+LaCl3與SNP處理相比CAT活性降低了23.78%，CaCl2+MB比CaCl2處理CAT活性降低了36.13%。

2.4 外源NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗MDA和脯氨酸含量的影響

由圖5可知，丙二醛含量隨滲透脅迫時(shí)間的延長而逐漸增加，滲透脅迫下MDA含量顯著高于CK。第2天時(shí)，15%PEG處理下MDA含量比CK顯著提高了95.81%(P<0.05)，外源添加SNP和CaCl2均能降低MDA的含量，從而緩解滲透脅迫對幼苗葉片細(xì)胞膜造成的損傷，其中SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理比PEG脅迫下丙二醛含量分別降低了23.54%，28.24%和31.15%，而添加外源SNP和CaCl2的同時(shí)添加抑制劑LaCl3和MB后抑制了MDA含量的降低，SNP+LaCl3和CaCl2+MB處理下MDA含量比PEG處理降低了2.29%和13.12%。第6天時(shí)CaCl2+MB處理下MDA含量為最大值，比PEG處理提高了9.84%，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理比PEG處理時(shí)MDA含量降低了21.07%，15.57%和22.93%。

圖2 SNP及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗SOD活性變化的影響Fig.2 Effects of SNP and Ca2+ on SOD activity in leaves of alfalfa seedlings under osmotic stress

圖3 SNP及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗POD活性變化的影響Fig.3 Effects of SNP and Ca2+ on POD activity in leaves of alfalfa seedlings under osmotic stress

圖4 SNP及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗CAT活性變化的影響Fig.4 Effects of SNP and Ca2+ on CAT activity in leaves of alfalfa seedlings under osmotic stress

圖5 SNP及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗MDA含量變化的影響Fig.5 Effects of SNP and Ca2+ on MDA content in leaves of alfalfa seedlings under osmotic stress

如圖6所示，紫花苜蓿幼苗葉片脯氨酸含量隨著滲透脅迫時(shí)間的延長而逐漸升高(CK變化緩慢)。第0天時(shí)各處理脯氨酸含量差異不顯著(P>0.05)，滲透脅迫后各處理間脯氨酸含量變化差異顯著(P<0.05)。第2天時(shí)，SNP+CaCl2共處理下脯氨酸含量顯著提高，SNP與CaCl2處理間無差異顯著性，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理分別比PEG處理顯著提高了20.52%，19.49%和33.76%。第6天時(shí)各處理葉片脯氨酸含量達(dá)到最大值，PEG處理比CK處理下葉片脯氨酸含量提高了43.70%，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理分別較PEG處理時(shí)顯著提高了23.69%，17.14%和30.92%，而SNP+LaCl3處理比PEG和SNP處理分別降低了7.25%和25.01%，CaCl2+MB處理比PEG和CaCl2處理分別降低了13.05%和25.77%。

2.5 外源NO與Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗POD同工酶的影響

圖6 SNP及Ca2+對滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗脯氨酸含量變化的影響Fig.6 Effects of SNP and Ca2+ on proline content in leaves of alfalfa seedlings under osmotic stress

如圖7所示，POD同工酶電泳共出現(xiàn)7條酶帶，其中A5、A6為共有酶帶，隨著PEG脅迫時(shí)間的延長POD同工酶組分發(fā)生變化，且在第4天時(shí)酶帶顏色最深且種類最多。PEG脅迫前，外源添加SNP、CaCl2及抑制劑MB、CaCl3的處理與CK相比出現(xiàn)A3酶帶。第4天時(shí)，與PEG處理相比，SNP、CaCl2及SNP+PEG處理使A1、A5和A6酶帶顏色加深，SNP+CaCl2處理下出現(xiàn)新酶帶A7，且A6酶帶顏色最深，A3酶帶消失；SNP+LaCl3處理下出現(xiàn)A2、A4酶帶，A1、A3酶帶顏色加深。第6天時(shí)，各處理POD活性降低，A3酶帶消失，SNP處理下A1、A5和A6酶帶顏色加深，CaCl2處理下A1酶帶消失，A5和A6酶帶顏色變淺。

圖7 外源NO與Ca2+調(diào)控滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片POD同工酶電泳圖譜Fig.7 Exogenous NO and Ca2+ regulate the POD isoenzyme electrophoresis atlas of alfalfa seedling leaves under osmotic stress

3 討論

3.1 NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)是紫花苜蓿適應(yīng)滲透脅迫的重要機(jī)制

植物受到干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)形成多種機(jī)制來適應(yīng)和抵御逆境，如清除活性氧、產(chǎn)生抗逆蛋白、積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。其中NO是一種重要的逆境脅迫反應(yīng)物質(zhì)，其對植物抵御干旱脅迫具有重要作用[24]。NO對植物抗逆調(diào)節(jié)途徑有：1) NO通過cGMP依賴途徑激活胞質(zhì)Ca2+通道調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的濃度來提高抗氧化酶活性，降低自由基的積累和膜脂氧化作用而緩解逆境脅迫。2) NO活化鈣依賴性蛋白激酶(CDPKs)而級(jí)聯(lián)放大信號(hào)調(diào)節(jié)抗逆基因的表達(dá)[25-26]。SNP是一種外源NO常用的供體，0.05 mmol·L-1SNP約能釋放2 μmol·L-1的NO[27]。有研究表明，外施SNP可提高胞內(nèi)Ca2+濃度誘導(dǎo)蠶豆(Viciafaba)保衛(wèi)細(xì)胞氣孔關(guān)閉[28]，促進(jìn)甘蔗(Saccharumofficinarum)類囊體膜色素蛋白復(fù)合體的裝配[29]，維持玉米(Zeamays)葉綠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[30]，提高黑麥草(Loliumperenne)光合色素和光能利用率[31]。此外，Ca2+在干旱下通過參與ABA信號(hào)通路誘導(dǎo)SOD、POD、APX以及GR等相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)[32]，調(diào)節(jié)活性氧清除系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)作用等使植物適應(yīng)干旱脅迫[33-34]。

3.2 NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)對滲透脅迫下紫花苜蓿光合色素及光合作用的調(diào)控

植物進(jìn)行光合作用的能量來自光合色素捕獲的光能，所以光合色素含量的高低與光合功能密切相關(guān)[35]。光合色素中葉綠素a是光反應(yīng)的中心色素分子，而葉綠素b是補(bǔ)光色素分子。類胡蘿卜素一方面作為光合色素吸收光能并傳遞給反應(yīng)中心，參與光合作用；又作為細(xì)胞內(nèi)源氧化劑吸收剩余光能，防止細(xì)胞膜脂過氧化[36]。本試驗(yàn)表明，滲透脅迫下單一施加SNP或Ca2+能顯著緩解紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素a及葉綠素b含量的下降,提高類胡蘿卜素含量，SNP與Ca2+共處理時(shí)效果最佳，而添加Ca2+抑制劑La3+和NO抑制劑MB后緩解作用受到抑制，說明NO介導(dǎo)的Ca2+能夠促進(jìn)光合色素的合成，也可能防止細(xì)胞膜脂過氧化。其主要原因可能是光合色素含量的增加提高了紫花苜蓿葉片的有效光合面積； 同時(shí)類胡蘿卜素含量的升高增強(qiáng)了對活性氧的猝滅，使細(xì)胞內(nèi)氧自由基的積累減少，緩解葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，從而增強(qiáng)光能的吸收與傳遞。光合速率降低的原因包括氣孔和非氣孔因素，Ci降低和Ls升高，氣孔因素是主要的；Ci升高和Ls下降則非氣孔因素是主要的[37]。本研究表明，滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片隨著Gs降低，Ci升高和Ls降低，導(dǎo)致Pn下降，表明凈光合速率的降低主要由非氣孔限制引起，這可能與滲透脅迫引起紫花苜蓿葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，光合細(xì)胞活性降低有關(guān)[38]。滲透脅迫下外施SNP、CaCl2及SNP+CaCl2共處理顯著抑制幼苗葉片Gs和Ls的降低和Ci的升高，而施加抑制劑后該作用相反，說明NO及Ca2+信號(hào)使葉片氣孔擴(kuò)張，導(dǎo)致外界CO2向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散的阻力減小，光合碳固定的底物增加，從而使凈光合速率提高[39]。這與劉建新等[31]的外源NO對滲透脅迫下黑麥草幼苗光合和生物發(fā)光特性的影響試驗(yàn)結(jié)果一致。由此可知，外源NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)緩解了滲透脅迫對紫花苜蓿葉片葉綠體和光合系統(tǒng)的傷害。

3.3 NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)對滲透脅迫下紫花苜?？寡趸到y(tǒng)的調(diào)控

水分虧缺時(shí)植物的生長及體內(nèi)生理代謝發(fā)生變化，如活性氧的大量積累導(dǎo)致植物抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，促使膜脂過氧化作用增強(qiáng)，從而破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能[40-41]。SOD、POD和CAT是細(xì)胞抵抗活性氧的重要保護(hù)酶，SOD能以O(shè)2-·為基質(zhì)發(fā)生歧化反應(yīng)清除O2-·起到解毒作用，SOD與O2-·歧化產(chǎn)生的H2O2由POD和CAT轉(zhuǎn)化為H2O和O2[42]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)可增加干旱下紫花苜蓿種子萌發(fā)率，主要通過提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，滲透脅迫下外源施加SNP可提高紫花苜蓿幼苗葉片SOD、POD、CAT活性、抑制MDA的產(chǎn)生，使植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，減緩膜脂氧化損傷，這與姜義寶等[43]的研究結(jié)果一致，外源施加CaCl2也具有相同的作用。逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)迅速積累脯氨酸，通過滲透調(diào)節(jié)作用維持細(xì)胞含水量和膨壓，還可以清除活性氧，降低細(xì)胞酸性，解除氨毒等[44]。添加SNP或CaCl2均提高了葉片中脯氨酸含量，且隨著脅迫時(shí)間的延長脯氨酸含量逐漸增加，SNP+CaCl2處理促進(jìn)效果最顯著。當(dāng)添加SNP同時(shí)添加Ca2+通道阻斷劑LaCl3，SOD、POD、CAT活性和脯氨酸含量均降低，MDA含量增加，施加CaCl2的同時(shí)施加NO抑制劑MB后，以上效果也會(huì)減弱，且抑制效果強(qiáng)于增施LaCl3，這與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)。說明NO介導(dǎo)的Ca2+通路在調(diào)控滲透脅迫下紫花苜蓿葉片抗氧化酶活性、膜脂結(jié)構(gòu)損傷及滲透平衡過程中有重要的作用，增強(qiáng)了紫花苜蓿幼苗抗逆能力。

POD同工酶電泳試驗(yàn)中，與CK相比各處理POD組分發(fā)生明顯變化，第4天時(shí)酶種類變化差異最顯著，這與圖3中 POD活性在第4天各處理均達(dá)到最大值相一致。第4天時(shí)SNP+CaCl2共處理使A7條帶下小分子量酶蛋白的合成增加，較大分子量的酶蛋白(A1、A2、A3)合成受到抑制。施加SNP的同時(shí)添加Ca2+通道阻斷劑LaCl3可以使A1～A4條帶下酶含量增加，且A2和A4為新出現(xiàn)酶帶，添加NO抑制劑A1條帶下酶的合成增加，說明阻斷NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)通路改變了苜蓿適應(yīng)脅迫的生理應(yīng)答路徑。因此可知，Ca2+參與NO信號(hào)傳導(dǎo)且Ca2+與NO存在著交叉作用來調(diào)節(jié)PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗生理應(yīng)答并起到保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)References：

[1] Fan L X, Liu G B, Xue S,etal. Synergistic effects of doubled CO2concentration and drought stress on photosynthetic characteristics ofMedicagosativa. Acta Agrestia Sinica, 2014, 22(1): 85-93.

樊良新, 劉國彬, 薛萐, 等. CO2濃度倍增及干旱脅迫對紫花苜蓿光合生理特性的協(xié)同影響. 草地學(xué)報(bào), 2014, 22(1): 85-93.

[2] Ghotbi-Ravandi A A, Shahbazi M, Shariati M,etal. Effects of mild and severe drought stress on photosynthetic efficiency in tolerant and susceptible barley (HordeumvulgareL.) Genotypes. Journal of Agronomy & Crop Science, 2015, 200(6): 403-415.

[3] Jaleel C A, Riadh K, Gopi R,etal. Antioxidant defense responses: physiological plasticity in higher plants under abiotic constraints. Acta Physiologiae Plantarum, 2009, 31(3): 427-436.

[4] Wendehenne D, Pugin A, Klessig D F. Nitric oxide comparative synthesis and signaling in animal and plant cells. Trends in Plant Science, 2001, 6(4): 177-183.

[5] Beligni M V, Lamattina L. Nitric oxide stimulates seed germination and de-etiolation, and inhibits hypocotyl elongation, three light-inducible responses in plants. Planta, 2000, 210(2): 215-221.

[6] Procházková D, Haisel D, Wilhelmová N,etal. Effects of exogenous nitric oxide on photosynthesis. Photosynthetica, 2013, 51(4): 483-489.

[7] Hao G P, Xing Y, Zhang J H. Role of nitric oxide dependence on nitric oxide synthase-like activity in the water stress signaling of maize seedling. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(4): 435-442.

[8] Lamotte O, Courtois C, Dobrowolska G,etal. Mechanisms of nitric-oxide-induced increase of free cytosolic Ca2+concentration inNicotianaplumbaginifoliacells. Free Radical Biology & Medicine, 2006, 40(8): 1369-1376.

[9] Zhang Y Y, Liu Y L. Source and function of nitric oxide in plants. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2004, 24(5):921-929.

張艷艷, 劉友良. 一氧化氮在植物體內(nèi)的來源和功能. 西北植物學(xué)報(bào), 2004, 24(5): 921-929.

[10] Khan M N, Mohammad F, Mobin M,etal. Tolerance of plants to abiotic stress: a role of nitric oxide and calcium. Switzerland: Springer International Publishing, 2014: 225-242.

[11] Liu J X, Wang J C, Wang R J,etal. Exogenous nitric oxide elevated alkali tolerance ofAvenanudaseedlings. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 110-117.

劉建新, 王金成, 王瑞娟, 等. 外源一氧化氮提高裸燕麥幼苗的耐堿性. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 110-117.

[12] Ozkan D, Kara P, Kerman K,etal. DNA and PNA sensing on mercury and carbon electrodes by using methylene blue as an electrochemical label. Bioelectrochemistry, 2002, 58(1): 119-126.

[13] Kawabata A, Umeda N, Takagi H. L-arginine exerts a dual role in nociceptive processing in the brain: involvement of the kyotorphin-Met-enkephalin pathway and NO-cyclic GMP pathway. British Journal of Pharmacology, 1993, 109(1): 73-79.

[14] Kaczmarek M, Fedorowicz-Strońska O, Gowacka K,etal. CaCl2treatment improves drought stress tolerance in barley (HordeumvulgareL.). Acta Physiologiae Plantarum, 2017, 39(1): 41.

[15] Zottini M, Costa A, De Michele R,etal. Salicylic acid activates nitric oxide synthesis inArabidopsis. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(6): 1397-1405.

[16] Shi J, Fu X Z, Peng T,etal. Spermine pretreatment confers dehydration tolerance of citrusinvitroplants via modulation of antioxidative capacity and stomatal response. Tree Physiology, 2010, 30(7): 914-922.

[17] Chen Y H, Kao C H. Calcium is involved in nitric oxide-and auxin-induced lateral root formation in rice. Plant Cell Reports, 2012, 249: 187-195.

[18] Yi Q, Wei X H, Qiang X,etal. Investigation into the mechanism of NO-mediated Ca2+signaling during seed germination and antioxidation inMedicagosativaunder drought stress. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 57-65.

弋欽, 魏小紅, 強(qiáng)旭, 等. NO介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)在干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化酶中的傳導(dǎo)作用研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(11): 57-65.

[19] Zou Q. Guide of plant physiological experiments. Beijing: China Agricultural Press, 2000: 72-74.

鄒琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 72-74.

[20] Liu W Y, Yang H W, Wei X H,etal. Effects of exogenous nitric oxide on seed germination, physiological characteristics and active oxygen metabolism ofMedicagotruncatulaunder NaCl stress. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(2): 85-95.

劉文瑜, 楊宏偉, 魏小紅, 等. 外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及抗氧化酶的研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(2): 85-95.

[21] Ji X, Liu G, Liu Y,etal. The bZIP protein fromTamarixhispida, ThbZIP1, is ACGT elements binding factor that enhances abiotic stress signaling in transgenicArabidopsis. BMC Plant Biology, 2013, 13(3): 1-13.

[22] Deuner S, Alves J D, Zanandrea I,etal. Stomatal behavior and components of the antioxidative system in coffee plants under water stress. Scientia Agricola, 2011, 68(1): 77-85.

[23] Aebi H. Catalaseinvitro. Methods in Enzymology, 1984, 105: 121-126.

[24] Zhang L, Zhao X, Wang Y J,etal. Crosstalk of NO with Ca2+in stomatal movement inViciafabaguard cells. Acta Agronomica Sinica, 2009, 35(8): 1491-1499.

張霖, 趙翔, 王亞靜, 等. NO與Ca2+對蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞氣孔運(yùn)動(dòng)的互作調(diào)控. 作物學(xué)報(bào), 2009, 35(8): 1491-1499.

[25] Gao H B, Chen G L, Han L H,etal. Calcium influence on chilling resistance of grafting eggplant seedling. Journal of Plant Nutrition, 2005, 27(8): 1327-1339.

[26] Jeandroz S, Lamotte O, Astier J,etal. There’s more to the picture than meets the eye: nitric oxide cross talk with Ca2+signaling. Plant Physiology, 2013, 163(2): 459-470.

[27] Delledonne M, Xia Y J, Dixon R A,etal. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature, 1998, 394: 585-588.

[28] Astier J, Besson-Bard A, Wawer L,etal. Nitric oxide signaling in plant: cross-talk with Ca2+, protein kinases and reactive oxygen species. Annual Plant Reviews, 2011, 42: 147-170.

[29] Silveira N M, Frungillo L, Marcos F C,etal. Exogenous nitric oxide improves sugarcane growth and photosynthesis under water deficit. Planta, 2016, 244(1): 181-190.

[30] Shao R X, Li L L, Zhang H F,etal. Effects of exogenous nitric oxide on photosynthesis if maize seedlings under drought stress. Scientia Agriculture Sinica, 2016, 49(2): 251-259.

邵瑞新, 李蕾蕾, 鄭會(huì)芳, 等. 外源一氧化氮對干旱脅迫下玉米幼苗光合作用的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(2): 251-259.

[31] Liu J X, Wang J C, Wang R J,etal. Effects of exogenous nitric oxide on photosynthetic and bioluminescent characteristics in ryegrass seedling under osmotic stress. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(1): 210-216.

劉建新, 王金成, 王瑞娟, 等. 外源一氧化氮對滲透脅迫下黑麥草幼苗光合和生物發(fā)光特性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 22(1): 210-216.

[32] Sang J, Zhang A, Lin F,etal. Cross-talk between calcium-calmodulin and nitric oxide in abscisic acid signaling in leaves of maize plants. Cell Research, 2008, 18(5): 577-588.

[33] Fan Q J, Liu J H. Nitric oxide is involved in dehydration/drought tolerance in poncirus trifoliata seedlings through regulation of antioxidant systems and stomatal response. Plant Cell Reports, 2012, 31(1): 145-154.

[34] Xu Z Z, Zhou G S. Responses of leaf stomatal density to water status and its relationship with photosynthesis in a grass. Journal of Experimental Botany, 2007, 59(12): 3317-3325.

[35] Li X G, Meng Q W, Jiang G Q,etal. The susceptibility of cucumber and sweet pepper to chilling under low irradiance is related to energy dissipation and water-water cycle. Photosynthetica, 2003, 41(2): 259-265.

[36] Yang Z X, Ding Y F, Zhang X Q,etal. Impacts of alternaria stress on characteristics of photosynthesis and chlorophyll fluorescence in two tobacco cultivars with different resistances. Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(12): 4146-4154.

楊志曉, 丁燕芳, 張小泉, 等. 赤星病脅迫對不同抗性煙草品種光合作用和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊? 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(12): 4146-4154.

[37] Farquhar G D, Sharkey T D. Stomatal conductance and photosynthesis. Annual Review of Plant Physiology, 1982, 33(3): 317-345.

[38] Mu L, He C G, Jiang H,etal. The effects of drought and heat stress on the photosynthetic characteristics of alfalfa. Acta Agrestia Sinica, 2014, 22(3): 550-555.

牟蘭, 何承剛, 姜華, 等. 干熱脅迫對紫花苜蓿光合特性的影響. 草地學(xué)報(bào), 2014, 22(3): 550-555.

[39] Lu C M, Qiu N W, Wang B S,etal. Salinity treatment shows no effects on photosystem Ⅱphotochemistry, but increase the resistance of photosystem Ⅱ to heat stress in halophyteSuaedasalsa. Journal of Experimental Botany, 2003, 54: 851-860.

[40] Hosseini Boldaji S A, Khavari-Nejad R A, Hassan Sajedi R,etal. Water availability effects on antioxidant enzyme activities, lipid peroxidation, and reducing sugar contents of alfalfa (MedicagosativaL.). Acta Physiologiae Plantarum, 2012, 34(3): 1177-1186.

[41] Quan W L, Liu X, Wang H Q,etal. Comparative physiological and transcriptional analyses of two contrasting drought tolerant alfalfa varieties. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 1256.

[42] Li X, Wu Y J, Sun L X. Growth and physiological responses of three warm-season turfgrasses to lead stress. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(4): 171-181.

李西, 吳亞嬌, 孫凌霞. 鉛脅迫對三種暖季型草坪草生長和生理特性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(4): 171-181.

[43] Jiang Y B, Yang Y R, Zheng Q H. Effects of exogenous nitric oxide on antioxidase and chlorophyll fluorescence of seedling of alfalfa under drought stress. Agricultural Research in Arid Areas, 2008, 26(2): 65-68.

姜義寶, 楊玉榮, 鄭秋紅. 外源一氧化氮對干旱脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊? 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2008, 26(2): 65-68.

[44] Liu Z J, Zhang X L, Bai J G,etal. Exogenous paraquat changes antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in drought-stressed cucumber leaves. Scientia Horticulturea, 2009, 121(2): 138-143.

張宇君, 趙麗麗, 王普昶, 等. 鹽旱交互對燕麥種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 27(5): 141-152.

Zhang Y J, Zhao L L, Wang P C,etal. Effects of interaction between Ca2+salt and drought stress on seed germination and seedling physiology of oats. Acta Prataculturae Sinica, 2018, 27(5): 141-152.