蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR分子標(biāo)記開發(fā)及遺傳多樣性評(píng)價(jià)

朱永群，彭丹丹，林超文，聶剛，許文志，黃琳凱，羅付香，彭建華，張新全*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,四川 成都 611130；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

蘇丹草(Sorghumsudanense)系高梁屬一年生草本植物，染色體數(shù)為20(2n=20)，其開花習(xí)性與一般禾本科植物不同，屬于異花授粉植物，因原產(chǎn)于非洲北部蘇丹地區(qū)而得名。蘇丹草具有耐旱、高產(chǎn)、營養(yǎng)價(jià)值豐富等特點(diǎn)，作為一種優(yōu)質(zhì)的禾本科牧草在世界各地廣泛栽培和使用[1-2]。自20世紀(jì)30年代由美國引入后，蘇丹草在我國的種植區(qū)域不斷擴(kuò)大，主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和寧夏等北部省區(qū)以及長江中下游地區(qū)，不僅可用于放牧、刈割青飼、調(diào)制青貯等為家畜所喜食，還具有“漁業(yè)青飼料之王”的美稱[3-4]。蘇丹草與高粱的雜交種高丹草(Sorghumbicolor×Sorghumsudanenes)因具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，亦是草業(yè)生產(chǎn)中一種重要的牧草，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益[5]。我國開展蘇丹草品種選育和整理工作始于20世紀(jì)70年代，但由于缺乏品種在不同條件下生長表現(xiàn)的系統(tǒng)性評(píng)價(jià)和研究，其選育多憑個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，缺乏一定的科學(xué)預(yù)見性，導(dǎo)致目前為止通過我國草品種審定的蘇、高丹草品種數(shù)還屈指可數(shù)，加之市面上銷售的草種子多存在魚龍混雜的現(xiàn)象，使得這一優(yōu)良牧草的利用、推廣和品種的更新受到嚴(yán)重的阻礙，與目前全國畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展對(duì)蘇、高丹草生產(chǎn)規(guī)模的需求極不協(xié)調(diào)[6-7]。

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSRs)，是一類由1～6個(gè)核苷酸堿基為基本單元，組成的較長串聯(lián)重復(fù)的DNA序列[8]。SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、覆蓋面廣、共顯性和易于操作等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于牧草和作物的基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等方面[9-10]。然而，傳統(tǒng)SSR分子標(biāo)記開發(fā)過程具有盲目性和隨機(jī)性，且開發(fā)成本高，開發(fā)效率低。雖然Zhan等[11]根據(jù)Gramene在線數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物,利用SSR標(biāo)記對(duì)多份蘇丹草及高粱材料間的多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究，盧杰等[12]和李杰勤等[13]利用了高粱(Sorghumbicolor)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags, EST)序列信息建立EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于蘇丹草證明了標(biāo)記的可行性，但迄今為止關(guān)于專門針對(duì)蘇丹草開發(fā)的SSR分子標(biāo)記還鮮有報(bào)道，且缺乏與性狀緊密相關(guān)的特異性標(biāo)記，嚴(yán)重制約了蘇丹草分子育種工作的進(jìn)程?；诟咄繙y序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)獲得的基因組轉(zhuǎn)錄信息用于分子標(biāo)記的開發(fā)，具有簡單快捷、高效準(zhǔn)確、引物通用性好、成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)，此外，還被證明標(biāo)記可以有效與植物非生物逆境脅迫下抗性和重要的農(nóng)藝性狀等緊密關(guān)聯(lián)[14-16]。因此，利用轉(zhuǎn)錄組信息開發(fā)SSR分子標(biāo)記被認(rèn)為是新時(shí)代提高作物遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種研究準(zhǔn)確性的有效途徑[17]，目前已成功運(yùn)用于苜蓿(Medicagosativa)[18]、鴨茅(Dactylisglomerata)[19]、芒草(Miscanthus)[20]等牧草種質(zhì)資源的研究中。在蘇丹草測序工作研究方面，雖然Li等[21]先前根據(jù)S772蘇丹草轉(zhuǎn)錄組測序信息開發(fā)了SNP和Indel標(biāo)記，但關(guān)于蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究，這為本工作的開展提供了契機(jī)。

本研究基于蘇丹草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果擬分析SSR位點(diǎn)分布特征，設(shè)計(jì)開發(fā)EST-SSR分子標(biāo)記，對(duì)蘇、高丹草共36份材料進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析，為豐富蘇丹草分子標(biāo)記類型、開發(fā)與利用轉(zhuǎn)錄組EST資源提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開展蘇丹草種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與DNA提取

本試驗(yàn)材料為來源于農(nóng)業(yè)部全國畜牧總站國家牧草種質(zhì)基因庫的蘇丹草及高丹草種質(zhì)資源共36份，材料編號(hào)及來源地見表1。試驗(yàn)從2017年1月起，對(duì)蘇丹草種子采用沙培法進(jìn)行培育。種子經(jīng)1% 次氯酸鈉消毒5 min并用蒸餾水沖洗幾遍后播種于盛有石英砂的培育盆中，放入光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，待發(fā)芽4 d后更換為Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)，溫度設(shè)置為白天25 ℃，夜晚22 ℃，時(shí)長各為12 h。待幼苗長至18 d左右(2片成熟葉片)，每份種質(zhì)資源隨機(jī)選取20個(gè)單株的幼嫩葉片等量混合并用植物DNA提取試劑盒(Qiagen)提取DNA(每份材料3個(gè)重復(fù))。所提DNA經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測純度和濃度，將檢測合格的DNA樣品置于-20 ℃冰箱保存。試驗(yàn)開始前將各DNA樣品取出一部分用TE(Tris-EDTA)緩沖液稀釋至10 ng·μL-1，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 SSR引物設(shè)計(jì)

在土壤肥料研究所土壤與耕作飼草研究室對(duì)烏拉特1號(hào)(Wulate No.1)蘇丹草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(SRR登錄號(hào)5183088)得到的13574條包含SSR位點(diǎn)的EST序列的基礎(chǔ)上，利用MISA 1.0軟件根據(jù)設(shè)定的單位大小和最小重復(fù)參數(shù)如1-10、2-6、3-5、4-5、5-5和6-5對(duì)位于非重復(fù)序列基因(unigenes)上的EST序列設(shè)計(jì)引物。用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)定參數(shù)：鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine, GC)含量40%～60%，退火溫度50～60 ℃，且上下游引物熔解溫度差值不超過5 ℃，引物長度18～23 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度范圍為100～300 bp獲得300對(duì)EST-SSR引物。所有引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 SSR擴(kuò)增及多態(tài)性檢測

從36份DNA樣品中隨機(jī)選取6份對(duì)300對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳分離鑒定后最終獲得54對(duì)條帶清晰、多態(tài)性良好的有效性引物用于進(jìn)一步遺傳多樣性研究(表2)。25 μL PCR擴(kuò)增體系包括2 μL模板DNA，0.5 μL Taq DNA 聚合酶 (2.5 U·μL-1)，12 μL 2×Taq PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，接下來94 ℃變性 45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在200 V下經(jīng)6%聚丙烯酰氨凝膠電泳預(yù)分離30 min后再轉(zhuǎn)入350 V下電泳1.5 h。并用0.1% AgNO3進(jìn)行銀染和50 bp marker 鑒定PCR產(chǎn)物大小，顯影完后用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上的情況，選取清晰可辨的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)相同遷移位置或長度一致的條帶有帶記為“1”，無帶記為“0”，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)的0/1矩陣，統(tǒng)計(jì)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增總帶數(shù)(total number of bands，TNB)和多態(tài)性條帶數(shù)(number of polymorphic bands，NPB)，計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(percentage of polymorphic bands，PPB)和引物多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)。其中，PPB=K/N×100%，式中:K為多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目；N為所測位點(diǎn)總數(shù)；PICi=1-∑Pij2，式中：PICi表示引物i的多態(tài)性信息含量，Pij表示引物i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率，引物i的總帶型從 1 到n。利用NTSYS-pc2.10e軟件對(duì)原始矩陣進(jìn)行分析，基于similarity程序計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)，用clustering程序中的SHAN進(jìn)行聚類分析，再根據(jù)Graphics程序中的tree plot繪制親緣關(guān)系樹形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR分布頻率

從蘇丹草轉(zhuǎn)錄組的80686條Unigene序列中共鑒定出17548個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在13574條Unigene序列中，發(fā)生頻率為16.82%(含有SSR的Unigene 數(shù)量占總Unigene 數(shù)量的百分比)，其中2965條Unigene序列含一個(gè)以上SSR位點(diǎn)，SSR分布頻率為21.75%(SSR 的個(gè)數(shù)與總Unigene 的數(shù)量比)，平均每43.14 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)(SSR 的個(gè)數(shù)占序列總長的百分比)。

表2 引物信息及序列Table 2 Primer and sequences information applied in this study

續(xù)表2 Continued Table 2

蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR種類包括一至六核苷酸6種重復(fù)類型，以單/一核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)類型最為豐富，分別占38.59%(6771)和39.09%(6860)，其次為二核苷酸重復(fù)，有3366個(gè)，占19.18%，四、五和六核苷酸重復(fù)遠(yuǎn)低于前3種重復(fù)類型，總計(jì)占3.14%(551)(表3)。

表3 基于重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)與重復(fù)數(shù)量分布Table 3 Frequencies of different SSR repeat motif types related to variation of repeat unit numbers

2.2 蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的分布特點(diǎn)

蘇丹草SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5～23次，其中5～8次重復(fù)的有9976個(gè)SSR，其次為9～12次重復(fù)，有6532個(gè)SSR，往后逐漸減少。單核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)跨度最大，在9～23次均有分布，其余核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中于5～8次，在13～23次幾乎沒有分布(表3)。

17548個(gè)SSR位點(diǎn)中，占優(yōu)勢(shì)重復(fù)的一、二和三核苷酸重復(fù)基元分別有2、4和10種，其中以A/T、AG/CT和CCG/CGG出現(xiàn)的頻率最高，分別占該重復(fù)基元類型的91.06%、46.67%和39.21%(表4)。

2.3 蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR引物篩選與多態(tài)性檢測

隨機(jī)選擇的300對(duì)引物經(jīng)初步篩選有77對(duì)引物未能擴(kuò)增出清晰的條帶，擴(kuò)增成功率為73.67%。對(duì)擴(kuò)增成功的223對(duì)引物做進(jìn)一步的篩選驗(yàn)證，得到54對(duì)(24.22%)在供試材料間表現(xiàn)出擴(kuò)增效果好、條帶清晰且在目標(biāo)條帶范圍內(nèi)的多態(tài)性引物，如圖1所示。54對(duì)有效引物在36份供試材料中共擴(kuò)增出275條清晰帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增5.09條帶，單個(gè)引物對(duì)最多擴(kuò)增條帶數(shù)為12，最少擴(kuò)增條帶數(shù)僅為2，擴(kuò)增片段大小介于110～273 bp，其中多態(tài)性條帶數(shù)有205條，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)平均值為73.02%，不同引物所揭示的供試材料的多態(tài)信息含量(PIC)介于0.10～0.94，平均值為0.41(表5)。

表4 重復(fù)基元類型的重復(fù)基元分布Table 4 Distribution of repeat motifs according to classified repeat types

圖1 引物J268對(duì)36份材料的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results by primer J268 on 36 accessions

2.4 基于蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR 的聚類分析

根據(jù)Nei[22]的方法用NTSYS-pc2.10e軟件統(tǒng)計(jì)分析36份供試蘇、高丹草材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析。36份供試材料的GS介于0.3922～0.9020，平均為0.6471。其中，遺傳相似系數(shù)最大的是29和30與29和31，達(dá)到0.9020，其次為30和31，29和32，31和32及27和35，達(dá)到0.8922，表明29、30、31和32這4份材料間及27和35這兩份材料間的親緣關(guān)系很接近。

由聚類結(jié)果(圖2)可知，在相似系數(shù)為0.61，將36份供試材料分為3大類群：1、19和20號(hào)歸為一類，1號(hào)為來源于甘肅的引進(jìn)品種，19和20號(hào)均為兩份栽培品種，分別來源于江蘇和遼寧；27和35號(hào)兩份高丹草材料以及來源于內(nèi)蒙古的烏拉特2號(hào)共3份材料歸為第2類群；剩余30份材料歸為第3類，這一類群在相似系數(shù)為0.69處又可歸為兩個(gè)亞類，其來源地為川渝地區(qū)的24、26和34號(hào)以及內(nèi)蒙古的28號(hào)均為引進(jìn)品種的4份材料歸為第一亞類，其余26份材料歸為另一亞類，根據(jù)種子庫提供的已有信息，該類材料大部分皆來源于甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古和四川地區(qū)。由于先前部分種子入庫時(shí)的登記信息不夠完善，且個(gè)別材料如登記為烏拉特2號(hào)的13號(hào)材料登記信息有待進(jìn)一步的核實(shí)。針對(duì)這一情況，可通過田間試驗(yàn)結(jié)合表型調(diào)查、抗性鑒定等來進(jìn)一步佐證。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)具有不依賴于物種全基因組信息就能快速、準(zhǔn)確的獲得全轉(zhuǎn)錄本序列信息的特點(diǎn)，近年來已成為各研究領(lǐng)域一種較為基礎(chǔ)的研究手段。本研究基于蘇丹草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析可知，SSR位點(diǎn)廣泛分布于蘇丹草RNA序列中，占檢測序列的16.82%，與鴨茅(16.43%)[23]、黨參(Codonopsispilosula)(16.1%)[24]、芒草(14.44%)[20]等的測序結(jié)果基本一致。蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR種類較為豐富，一至六核甘酸重復(fù)類型均有出現(xiàn)，單核苷酸重復(fù)僅次于三核甘酸，其次為二核苷酸重復(fù)，其他重復(fù)類型所占比例很小，這一分布規(guī)律在高粱EST-SSR中也有體現(xiàn)[13]。核苷酸的重復(fù)類型因植物種類的不同而存在一定的差異，主要體現(xiàn)在以二核苷酸和三核苷酸重復(fù)為主導(dǎo)所占比例的差別上。本研究蘇丹草中三核苷酸重復(fù)所占比例最高，與Yates等[25]、Huang等[26]和Cardoso-Silva等[27]分別在紅三葉(Trifoliumpratense)、牛鞭草(Hemarthria)和甘蔗(Saccharumofficinarum)中的研究結(jié)果相一致。 由于密碼子是以三核苷酸為一個(gè)功能單位， 在一個(gè)DNA的閱讀框內(nèi)三核苷酸發(fā)生遷移突變對(duì)氨基酸聚合物形成的蛋白質(zhì)不會(huì)造成太大的影響[28]，這可能合理的解釋了為何大多數(shù)植物中三核苷酸為最為豐富的重復(fù)類型的現(xiàn)象。在大多數(shù)的單子葉植物中，AG/CT和CCG/CGG分別為二核苷酸和三核苷酸的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元[29]，本研究結(jié)果也剛好印證了這一點(diǎn)。蘇丹草轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記中單核苷酸和三核苷酸SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)多，尤其以單核苷酸重復(fù)基元的跨度最大，在9～23次均有分布。研究表明，核苷酸的重復(fù)次數(shù)與SSR標(biāo)記的多態(tài)性呈正相關(guān)[30]，所以理論上這兩種核苷酸SSR具備更為豐富的多態(tài)性，可作為潛在的SSR重復(fù)基元進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和分子標(biāo)記開發(fā)。

表5 54對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果Table 5 The amplification results of 54 SSR primer pairs

圖2 EST-SSR對(duì)36份材料的UPGMA聚類分析Fig.2 UPGMA cluster of 36 accessions based on EST-SSR markers

根據(jù)EST-SSR是對(duì)基因內(nèi)部變異進(jìn)行直接評(píng)價(jià)的這一特點(diǎn)，本研究利用包含不同重復(fù)基元的54對(duì)多態(tài)性引物應(yīng)用于34份蘇丹草和2份高丹草材料中進(jìn)行分子標(biāo)記擴(kuò)增分析，得到較多的變異位點(diǎn)，其中73.05%的擴(kuò)增片段能夠揭示材料間的遺傳差異，均值為0.41的多態(tài)信息含量(PIC)反映了供試材料間的遺傳多樣性水平。一般來說，PIC含量越高，表明群體變異程度越大，物種的遺傳多樣性越豐富[31]。這說明基于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的EST-SSR對(duì)蘇丹草遺傳多樣性的檢測具有一定的有效性，同時(shí)也證明了供試材料具有較為豐富的遺傳變異類型。

基于遺傳相似系數(shù)(GS)的分析也能印證以上結(jié)論。36份供試材料的平均GS為0.6471，表明供試材料間具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，而27和35號(hào)兩份高丹草材料其GS為0.8922，聚類結(jié)果也歸為一類，表明蘇丹草轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR引物擴(kuò)增出的特異位點(diǎn)能夠有效地將蘇丹草與高丹草材料進(jìn)行區(qū)別。另外，采自于川渝地區(qū)的29、30、31和32號(hào)4份材料間的GS值較高，且其聚類結(jié)果與地理來源基本一致，說明來自于同一地區(qū)的材料遺傳變異較小。以上結(jié)果均表明根據(jù)蘇丹草轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)蘇、高丹草遺傳變異和親緣關(guān)系的鑒別能力具有一定的可行性，可有效應(yīng)用于蘇、高丹草種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)中。

根據(jù)EST-SSR標(biāo)記具有很好的通用性這一特點(diǎn)，EST-SSR引物不僅可運(yùn)用于近源物種的遺傳多樣性研究，如將高粱EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于蘇丹草及高丹草[13]，將高丹草EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于蘇丹草和高粱[31]等。此外，陳永霞等[32]還將玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和高粱3種禾谷類作物的EST-SSR引物成功用于扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)的跨種擴(kuò)增研究其遺傳多樣性水平。本研究根據(jù)蘇丹草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)大量本草種EST-SSR分子標(biāo)記，通過遺傳多樣性分析揭示了所開發(fā)的引物具有良好的特異性，在這一基礎(chǔ)上，以后可將這54對(duì)特異性SSR引物運(yùn)用到高粱、高丹草以及其他禾本科牧草、草坪草甚至是禾谷類作物等的遺傳多樣性研究工作中。由于EST-SSR來源于序列相對(duì)保守的基因組編碼區(qū)，相同引物因與不同材料的基因組互補(bǔ)DNA片段數(shù)目和位點(diǎn)而不同，擴(kuò)增產(chǎn)物大小和數(shù)目也存在一定差異，故擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了材料的遺傳多樣性，為基因功能多樣性的研究提供了可能[33]。因此，利用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)草種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，可以更好地開發(fā)和利用優(yōu)良基因資源，保護(hù)和鑒定基因的多樣性，并可通過對(duì)材料的親緣關(guān)系進(jìn)行梳理[34]，為雜交育種選育新品系奠定基礎(chǔ)，提高品種選育工作的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究基于蘇丹草轉(zhuǎn)錄組測序分析明確了蘇丹草SSR位點(diǎn)分布的總體特征，利用SSR位點(diǎn)數(shù)目和種類均較為豐富的EST序列開發(fā)了54個(gè)特異的蘇丹草SSR分子標(biāo)記，建立了高效開發(fā)蘇丹草特異標(biāo)記的新途徑，為今后蘇丹草及近源物種遺傳組成的鑒定、遺傳多樣性研究、“三性”測試(DUS)和分子標(biāo)記輔助育種奠定了重要基礎(chǔ)。

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