人參皂苷Rb2對高脂性脂肪肝小鼠肝臟脂質代謝的影響及其機制

洪逸蓮，顧雪疆，徐靜，林怡，斯琪雅

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 內分泌科，浙江 溫州 325015）

脂肪肝指由于各種因素導致的肝細胞內脂質過度積聚的病變，與肥胖等代謝性疾病密切相關，被認為是代謝綜合征的肝表現[1-3]。人參為中國傳統(tǒng)中藥，被廣泛用于治療各種代謝性疾病，如高血糖、高血脂和慢性肝臟疾病[4]。人參皂苷（ginsenoside）是人參的主要有效成分之一。研究證明人參及其有效成分人參皂苷具有降血脂、抗肝損傷等作用[5]。人參皂苷Rg3、Rg5、Rb1均可以改善肝臟脂肪變性[6-9]。最新研究報道人參皂苷Rb2能通過調節(jié)自噬信號通路，阻止肝臟脂質積累，改善糖耐量[10]。

目前，關于人參皂苷Rb2對肝臟脂質代謝的影響研究較少。本研究通過建立高脂性脂肪肝小鼠模型，并用人參皂苷Rb2處理，探討人參皂苷Rb2對肝臟脂質代謝的作用及其機制，以期進一步研究人參皂苷Rb2的藥用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠18只購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號：SCXK（滬）2007-0005]，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物中心清潔級動物房，自由攝食與飲水，溫度（22±3）℃，濕度50%±5%，每天光照與黑夜時間各為12 h。

1.2 試劑和儀器 人參皂苷Rb2購自上海源葉生物有限公司，10% kcal對照飼料和60% kcal高脂飼料購自江蘇美迪森公司，兔抗小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）抗體購自英國Abcam公司，反轉錄試劑盒購自立陶宛MBI公司，熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀（IQ5）均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 高脂性脂肪肝模型制備及給藥 C57BL/6J雄性小鼠隨機分成正常對照組、高脂模型組和人參皂苷Rb2組，普通飼料適應1周，正常對照組予10%kcal對照飼料，其余2組予60% kcal高脂飼料喂食8周，稱體質量。造模結束后，人參皂苷Rb2組予40 mg·kg-1·d-1人參皂苷Rb2腹腔注射，時間為早上9：00-10：00，連續(xù)注射10 d，正常對照組和高脂模型組予PBS相應處理。

1.4 肝組織標本制備 實驗動物禁食12 h后，用水合氯醛麻醉處死小鼠，取肝組織稱重，部分肝組織以4%多聚甲醛溶液固定，用于普通病理染色；其余肝組織液氮速凍，-80 ℃保存。

1.5 肝質量系數計算 計算肝質量系數：肝質量系數=肝臟質量（g）/體質量（100 g）。

1.6 肝組織形態(tài)學檢查 對4%多聚甲醛溶液固定的肝組織進行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后于光學顯微鏡下進行病理形態(tài)學檢查。

1.7 實時熒光定量PCR檢測基因表達 檢測脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、固醇調節(jié)元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）-1c、肉堿棕櫚酰轉移酶（carnitine palmitoyl transferase，CPT）-1、膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、PPARα、二酰甘油?；D移酶（diacylgycerol acyltransferase，DGAT）基因表達。利用Trizol法提取RNA。取2 μg RNA，按Revertra First Strand cDNA Synthesis kit說明書進行反轉錄，合成cDNA，然后以其為模板加入引物和SYBR，按說明書進行實時熒光定量PCR分析。實驗所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，具體序列如表1所示。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測蛋白表達 取20 mg組織樣本，加入200 uL蛋白裂解液（蛋白裂解液:PMSF為100:1），勻漿機研磨均勻。低溫離心15 000 r/min，20 min，將無色透明上清液移至新的EP管中，BCA法測蛋白濃度，后加入適量loading buffer，100 ℃變性5 min后-20 ℃低溫保存。SDS-PAGE膠制備10%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳槽內加入一定量的電泳液，SDS-PAGE膠固定好后放入電泳槽，每孔加入等量蛋白；80 V恒壓30 min后，加壓至100～120 V恒壓，待目的蛋白至電泳夾底部中下時，停止電泳，低溫220 mA恒流轉膜1 h，5%牛奶封閉液4 ℃封閉過夜；將PPARα抗體與一抗稀釋液1:1 000配制成工作液，4 ℃水平搖床中孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，山羊抗兔二抗室溫水平搖床中孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；曝光。

1.9 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數據處理。計量資料用±s表示，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝臟組織學觀察 光學顯微鏡下觀察，正常對照組肝細胞排列呈索狀，結構正常；高脂模型組小鼠肝組織可見細胞質中出現大小不等的脂肪空泡，呈脂肪變性；人參皂苷Rb2組與高脂模型組相比，脂肪空泡數目和體積明顯減少，脂肪變性程度減輕，見圖1。

圖1 3組小鼠肝臟HE染色（×40）

2.2 體質量、肝質量和肝質量系數 高脂喂食明顯增加了小鼠的體質量及肝質量，人參皂苷Rb2腹腔注射后，小鼠體質量、肝質量比高脂模型組分別降低了5.66%和12.97%，肝質量系數亦明顯下降（均P＜0.05），見表2。

表2 3組體質量、肝質量、肝質量系數（n=6， ±s）

表2 3組體質量、肝質量、肝質量系數（n=6， ±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與高脂模型組比：bP＜0.05

組別 體質量（g）肝質量（g） 肝質量系數正常對照組 25.000±3.360 1.211±0.275 4.844±0.561高脂模型組 35.320±3.293a1.542±0.236a4.366±0.381a人參皂苷Rb2組 33.050±2.831b1.301±0.181b3.936±0.309b

2.3 肝臟脂肪代謝相關基因的表達 與正常對照組相比，高脂模型組LPL、DGAT、SREBP-1c、FAS基因表達量顯著增加（P＜0.05），CYP7A1、CPT-1表達量顯著下降（P＜0.05）；與高脂模型組相比，人參皂苷Rb2組肝臟組織LPL、SREBP-1c、FAS基因表達量明顯下降（P＜0.05），DGAT未見明顯變化（P＞0.05），CYP7A1、CPT-1表達量明顯增加（P＜0.05），見表3。

2.4 肝臟PPARα信號通路的表達 本研究在基因水平和蛋白水平進一步檢測了肝臟PPARα蛋白和基因的表達，結果顯示高脂模型組與正常對照組比較，PPARα表達明顯抑制，而人參皂苷Rb2可明顯增加肝臟PPARα的表達（見表4）。

表3 3組肝臟脂肪代謝相關基因表達（n=6， ±s）

表3 3組肝臟脂肪代謝相關基因表達（n=6， ±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與高脂模型組比：bP＜0.05

組別 LPL DGAT SREBP-1c FAS CYP7A1 CPT-1正常對照組 0.579±0.062 1.207±0.240 0.704±0.104 0.130±0.069 0.170±0.012 1.049±0.211高脂模型組 1.168±0.180a 1.396±0.427a 2.945±0.228a 0.897±0.129a 0.100±0.024a 0.728±0.234a人參皂苷Rb2組 0.958±0.292b 1.218±0.436 1.181±0.584b 0.267±0.211b 0.203±0.020b 1.091±0.214b

表4 3組PPARα表達變化（n=6， ±s）

表4 3組PPARα表達變化（n=6， ±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與高脂模型組比：bP＜0.05

組別 PPARα基因 PPARα蛋白正常對照組 1.407±0.170 0.485±0.072高脂模型組 0.599±0.088a 0.199±0.011a人參皂苷Rb2組 1.000±0.108b 0.383±0.052b

3 討論

高脂飲食干預是造成包括肥胖、脂肪肝、胰島素抵抗在內的諸多代謝性疾病模型的成熟方式。長期的高脂飲食能夠增加動物模型的β細胞氧化，導致胰島素抵抗，造成甘油三酯（triglyceride，TG）異位積聚，增加非氧化脂肪酸的代謝、脂質過氧化和脂質凋亡[11]。本研究通過高脂飲食建立穩(wěn)定的高脂性脂肪肝模型，結果顯示，高脂模型小鼠體質量、肝質量明顯增加，同時伴有肝臟脂肪變性、脂質代謝障礙。

脂質代謝是生物體內能量代謝的重要方式，是指在各種酶的幫助下，體內脂肪消化、吸收、合成、分解的過程。DGAT、FAS、SREBP-1c是脂肪合成的關鍵酶[12-13]，其表達增加可以導致肝內TG沉積。LPL在TG代謝中起著關鍵作用，可將極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的TG裂解成甘油和脂肪酸，使極低密度脂蛋白和乳糜微粒分解產物轉變成高密度脂蛋白膽固醇[14]。CYP7A1是膽固醇轉化成膽汁酸的限速酶[15-16]，其表達上調將會降低血漿膽固醇濃度。CPT-1是脂肪酸氧化限速酶[17]，在β氧化過程當中，催化長鏈?；o酶A轉化為長鏈酰基肉堿。本研究顯示，高脂飲食增加SREBP-lc、FAS、LPL、DGAT基因表達，抑制CYP7A1、CPT-1基因表達，而人參皂苷Rb2可以顯著下調SREBP-lc、FAS、LPL基因表達，上調CYP7A1、CPT-1基因表達，促進肝臟脂肪分解，抑制脂肪合成。

PPARα是調節(jié)機體能量代謝和線粒體、過氧化酶體及微粒體脂肪酸氧化的關鍵因子，可在多個環(huán)節(jié)調節(jié)游離脂肪酸及脂質在肝臟的代謝，在脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[18-19]。PPARα還可以減輕炎癥反應，改善肝臟氧化應激，阻止肝組織損傷發(fā)生[20]。PPARα激動劑可以明顯減少血漿TG含量，改善肝臟脂肪變性，增加胰島素敏感性[21-22]。本研究中，高脂模型組肝臟PPARα表達顯著下降，經人參皂苷Rb2處理后，在基因和蛋白水平高脂小鼠肝臟PPARα均顯著改善，結果顯示人參皂苷Rb2可以逆轉高脂飲食導致的PPARα表達下降。

綜上所述，人參皂苷Rb2下調脂代謝相關基因FAS、LPL和SREBP-1c表達，上調CPT-1和CYP7A1表達，增加肝臟PPARα的表達，減少肝臟脂肪細胞TG和脂肪酸的合成，促進脂肪酸過氧化，進而發(fā)揮改善肝臟脂肪代謝，減少肝細胞脂質沉積的作用。

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