人脂肪間充質(zhì)干細胞對宮頸癌細胞的趨化性

鄭麗紅，劉翊，朱雪瓊

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

宮頸癌在女性惡性腫瘤中的死亡率位居第三，尤其是晚期宮頸癌患者，其5年生存率僅為40%[1-2]。目前，對于晚期宮頸癌患者，順鉑是最有效的化療藥物，然而順鉑缺乏對宮頸癌的靶向功能[3-4]，因此，探索靶向治療宮頸癌的方法十分必要。

間充質(zhì)干細胞是成人非造血干細胞，廣泛存在于各種器官和組織的基質(zhì)[5]。研究表明，間充質(zhì)干細胞對許多類型的實體瘤具有趨向性，如肝癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、骨髓瘤等[6-9]，可作為靶向治療的良好載體。也有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可作為載體細胞攜帶TRAIL、IL-21、IFN-β等因子靶向治療腫瘤[10-12]。本研究提取人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞（human adipose tissue derived mesenchymal stem cell，hATMSC），并探討其對宮頸鱗癌細胞和腺癌細胞的趨化性，為將間充質(zhì)干細胞研發(fā)成為宮頸癌靶向治療載體提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 研究方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。皮下脂肪取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行剖宮產(chǎn)手術(shù)的產(chǎn)婦，均已簽署知情同意書。人宮頸鱗癌細胞SiHa、MS751、C33-A、CaSki及宮頸腺癌細胞Hela均購于中國科學(xué)院上海細胞研究所細胞庫。分化培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；流式表型鑒定相關(guān)的CD90、CD44、CD105、HLAABC、CD34、CD45和HLA-DR抗體均購于美國BD公司。

1.2 hATMSC分離培養(yǎng) 無菌條件下取剖宮產(chǎn)手術(shù)患者的皮下脂肪組織1 cm×1 cm×2 cm，將脂肪組織與表面的結(jié)締組織包膜及血管相分離后，用含4%青鏈霉素的PBS洗3次，剪碎后加入0.075% I型膠原酶，于37 ℃水浴孵60 min。用含血清的培養(yǎng)基終止消化，細胞濾器過濾，離心，PBS洗2次。用低糖DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素重懸，接種到T25細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。48 h后首次換液。

1.3 hATMSC多向分化誘導(dǎo)及檢測 hATMSC以1×105/mL的密度接種于6孔板中，進行多向分化誘導(dǎo)及檢測：①誘導(dǎo)分化為成骨細胞：加入成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，誘導(dǎo)完成后進行堿性磷酸酶染色；②誘導(dǎo)分化為脂肪細胞：加入成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，誘導(dǎo)完成后進行油紅染色。

1.4 流式細胞技術(shù)檢測hATMSC表面標志物 取生長良好的第3代間充質(zhì)干細胞，胰酶消化，用含2.5%胎牛血清的PBS封閉10 min，收集細胞，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃下避光孵育30 min，最后用200 μL PBS重懸后用流式細胞儀檢測。

1.5 qRT-PCR檢測hATMSC中OCT-4 mRNA的表達 取第4～第6代hATMSC，用Trizol提取總RNA，取1 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體積20 μL。OCT-4引物：上游5’-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCT-3’；下游5’-CAA GGGCCGCAGCTTACACATGTT-3’；GAPDH為內(nèi)參：上游5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’；下游5’-GTCAAAGGTGGAGGA GTGG-3’。取1 μL cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，采用10 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共循環(huán)45次。成纖維細胞中OCT-4 mRNA的表達作為對照組。

1.6 Transwell實驗檢測hATMSC向5種宮頸癌細胞的趨化 分別將生長狀態(tài)良好的5種宮頸癌細胞按1×105/孔接種于Transwell下室，同時設(shè)置陰性對照組為不含腫瘤細胞的無血清培養(yǎng)基。第2天，將腫瘤細胞換液為無血清的培養(yǎng)基。將生長狀態(tài)良好的hATMSC用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度，每孔2×104個細胞，加入Transwell上室，并將Transwell上室置入含腫瘤細胞和不含腫瘤細胞的無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后取出Transwell上室，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下（×100）觀察向下室遷移的hATMSC數(shù)目。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)采用Stats統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的2組之間采用LSD法進行比較，方差不齊的2組之間采用Dunnett’s法進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hATMSC的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)細胞48 h后，鏡下可見散在貼壁梭形細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，細胞形態(tài)逐漸均一，排列呈魚群樣。約1周后細胞融合度至80%左右，此時進行細胞傳代。第3代后的hATMSC均勻良好。第3～第10代的細胞形態(tài)無明顯改變，均呈旋渦狀，見圖1。

2.2 hATMSC分化能力 用成骨、成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，堿性磷酸酶染色后看到成片的深棕色鈣沉積顆粒，油紅染色看到紅色脂滴，見圖2。

圖1 hATMSC形態(tài)學(xué)觀察（×100）

2.3 hATMSC表型鑒定結(jié)果 間充質(zhì)干細胞特異性標志物CD90、CD44、CD105、HLA-ABC陽性率分別為（99.08±0.56）%、 （99.45±0.54）%、 （98.61±0.50）%和（97.45±4.28）%，而造血干細胞標志物CD34和CD45的陽性表達率僅為（0.17±0.02）%、 （0.02±0.02）%，HLA-DR的陽性率為（0.02±0.02）%，提示間充質(zhì)表型陽性，而造血干細胞表型為陰性，符合間充質(zhì)干細胞的特點，見圖3。

2.4 qRT-PCR檢測hATMSC中OCT-4 mRNA的表達 采用qRT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，hATMSC中OCT-4 mRNA的表達為成纖維細胞的（698.12±11.23）倍，說明hATMSC中OCT-4呈高表達。

圖2 hATMSC分化能力鑒定（×100）

圖3 流式細胞技術(shù)鑒定hATMSC表型

2.5 hATMSC體外向?qū)m頸癌細胞的趨化 體外遷移實驗結(jié)果表明，在Transwell共培養(yǎng)體系下室為宮頸癌細胞SiHa、MS751、C33-A、CaSki、Hela和陰性對照組中，趨化至膜對側(cè)的hATMSC細胞數(shù)分別為145.0±3.6、123.4±2.3、181.1±4.7、95.7±6.4、106.5±8.2和17.0±2.6，宮頸癌細胞各組中hATMSC遷移數(shù)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示hATMSC對宮頸鱗癌細胞和腺癌細胞均有明顯的趨化性，其中，C33-A細胞誘導(dǎo)hATMSC細胞遷移的能力最強，SiHa、MS751、Hela細胞次之，而CaSki細胞相對較弱。見圖4。

圖4 hATMSC對不同宮頸癌細胞的遷移能力

3 討論

間充質(zhì)干細胞對多種實體瘤具有趨向性[6-9]，但對宮頸癌的趨向性研究卻鮮見報道。hATMSC具有以下優(yōu)點：脂肪組織來源廣泛、容易獲得；人體脂肪組織含量大；免疫原性低，可以通過MHC限制性，為體外移植創(chuàng)造條件，利于后續(xù)的進一步研究。因此，本研究分離、原代培養(yǎng)和鑒定hATMSC，并探討其對不同宮頸癌細胞的趨化性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hATMSC對宮頸鱗癌細胞和腺癌細胞均有明顯的趨化性。經(jīng)比較分析，C33-A細胞誘導(dǎo)hATMSC的遷移能力最強，SiHa細胞、MS751細胞、Hela細胞次之，而CaSki細胞相對較弱，提示hATMSC可能可作為載體靶向治療宮頸鱗癌和腺癌。在后續(xù)的在體動物實驗研究中，可以選擇C33-A細胞來構(gòu)建原位的宮頸癌裸鼠模型，進一步研究hATMSC作為藥物載體，對宮頸癌細胞的靶向作用。

盡管本研究結(jié)果證實了hATMSC對宮頸癌細胞具有明顯的趨向性，但hATMSC的生物安全性尚需進一步檢驗。林琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞對體外Hela細胞的增殖沒有影響，但會促進Hela細胞在體內(nèi)的生長。但劉華等[14]和劉世凱等[15]均發(fā)現(xiàn)，臍帶來源的間充質(zhì)干細胞可抑制Hela細胞的增殖，且呈濃度依賴性。CHO等[16]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪和羊水來源的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基的上清液能夠明顯抑制C33-A的增殖，經(jīng)過熱處理后該抑制作用更加明顯。劉華等[14]還發(fā)現(xiàn)人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞可以促進宮頸癌細胞的凋亡。因此，不同組織來源的間充質(zhì)干細胞對宮頸癌生物學(xué)行為的影響尚待研究。

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