基于1H NMR的代謝組學(xué)分析糖尿病腎病小鼠血清的代謝模式

魏婷婷，趙良才，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.實驗動物中心；2.藥學(xué)院）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathies，DN）是糖尿病主要慢性并發(fā)癥之一，在糖尿病人群中發(fā)病率高，是引發(fā)終末期腎功能衰竭的主要原因[1]。其具體發(fā)病機制目前尚不明確。目前，臨床上對DN的診斷主要依賴于對尿微量白蛋白排泄率的檢測，但該方法受肥胖、胰島素抵抗等諸多因素影響[2]。在蛋白尿和組織病理改變出現(xiàn)前，機體中一些代謝物和代謝途徑就已發(fā)生特征性改變，這些特征性的代謝變化很有可能就是DN發(fā)展演化過程中的潛在生物標(biāo)志物[3-4]。因此，從代謝角度了解DN的發(fā)病機制對其預(yù)測、診斷和治療起到關(guān)鍵性作用?；诤舜殴舱駳渥V（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）的代謝組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于疾病的早期診斷、發(fā)病機制、藥物研究等。本研究通過1H NMR的代謝組學(xué)方法探索db/db小鼠血清代謝物的改變和相關(guān)代謝途徑，以期尋找DN相關(guān)的生物標(biāo)記物。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8周齡的雄性DN模型db/db小鼠8只，體質(zhì)量為50～70 g；雄性C57BL/6J野生型小鼠9只，體質(zhì)量為20～30 g，購自南京大學(xué)模式動物研究所，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房，動物許可證號：SYXK（浙）2010-0150。

1.2 試劑與儀器 三甲硅烷基丙磺酸鈉（TSP）購自美國Sigma公司；D2O（99.9%氘代）購于英國劍橋同位素實驗室；血糖試紙及血糖儀（德國貝朗醫(yī)療國際貿(mào)易有限公司）；Bruker AVANCE III 600 MHz NMR波譜儀（德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集：小鼠飼養(yǎng)至17周時，用小鼠代謝籠收集db/db小鼠與野生型小鼠的尿液。接尿前12 h和接尿過程中嚴(yán)格禁食，并且在接尿管內(nèi)加50 μL 1%疊氮化鈉作為防腐劑，置于冰中接尿使其保持低溫。收集完畢，低溫離心（3 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。尿液收集后進(jìn)行眼眶取血，血液靜置30 min后離心（3 000×g，4 ℃，15 min），取上清液用于1H NMR檢測，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生化指標(biāo)檢測：采用血糖儀檢測小鼠尾靜脈的血糖值，采用全自動生化分析儀（MINDRAY BS-300）檢測小鼠尿液中的生化指標(biāo)，包括尿肌酐（urine creatinine，UCr）、尿白蛋白肌酐比（uri

nary albumin to creatinine ratio，UACR），具體操作按試劑盒要求進(jìn)行。

1.3.3 血清的1H NMR檢測：將150 μL解凍的血清與300 μL的磷酸緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.4）混合，并加入50 μL D2O用于鎖場。采用一維CPMG脈沖序列在298 K溫度下采集血清1H NMR譜。譜寬12 000 Hz，弛豫延遲4 s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)32 K，累加64次，F(xiàn)ID充零至64 K后，加窗函數(shù)進(jìn)行傅立葉變換。對所有1H NMR譜進(jìn)行相位校正和基線調(diào)整，并以乳酸的甲基峰定標(biāo)（CH3，δ1.33）。

1.3.41H NMR波譜數(shù)據(jù)處理和模式分析：將1H NMR譜進(jìn)行自動分段積分，分別進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analys，PLS-DA）和定量分析。為了消除飽和水峰時引起的譜線扭曲，除去預(yù)飽和壓水峰后的殘留水峰區(qū)。由于譜圖中葡萄糖峰非常顯著，因此需去除此峰，否則其高濃度會影響到后面的分析結(jié)果[5]。為了補償樣本間的濃度差異，對每段積分值都相對于該譜的所有積分值進(jìn)行歸一化處理。將歸一化后得到的積分值導(dǎo)入SIMCA-P+ 12.0軟件包（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行PLS-DA。PLS-DA的第一主成分（principal component1，PC1）和第二主成分（principal component2，PC2）可以代表矩陣中最大的信息變量，其構(gòu)建的得分圖上的每一個點代表一個樣本的代謝模式；相應(yīng)的載荷圖反映積分區(qū)間對分組的貢獻(xiàn)[6-7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。UACR、UCr與血清1H NMR檢測的多種代謝物間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠生化指標(biāo)比較db/db小鼠在整個實驗周期中體質(zhì)量均超過野生型小鼠的2倍，呈明顯的肥胖狀態(tài)；從生化指標(biāo)來看，db/db小鼠的血糖、UACR均超過野生型小鼠的2倍，而UCr則顯著降低，不足野生型小鼠的1/5。這一變化表明db/db小鼠呈現(xiàn)出典型的糖尿病癥狀，且存在一定的腎損傷。

2.2 血清1H NMR譜結(jié)果 通過1H NMR譜可以同時獲得許多小分子代謝物信息，其代謝物歸屬為：低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白（LDL/VLDL，δ0.85），異亮氨酸/亮氨酸（isoleucine/leucine，I/LEU，δ0.95），3-羥基丁酸（3-hydroxybutyrate，3-HB，δ1.19），乳酸（lac-tate，LAC，δ1.33，δ4.10），丙氨酸（alanine，ALA，δ1.47），乙酸（acetate，ACE，δ1.91），乙酰乙酸（acetoacetate，ACA，δ2.27），丙酮酸（pyruvate，PYU，δ2.36），谷氨酰胺（glutamine，GLI，δ2.46），檸檬酸（citrate，CIT，δ2.52），肌酸（creatine，CRE，δ3.03），膽堿（choline，CHO，δ3.19），甘氨酸（glycine，GLY，δ3.55），甘油（glycerol，GLL，δ3.65），β-葡萄糖（β-glucose，β-GLU，δ4.65），α-葡萄糖（α-glucose，α-GLU，δ5.24），酪氨酸（tyrosine，TYR，δ6.89），組氨酸（histidine，HIS，δ7.07），苯丙氨酸（phenylalanine，PHE，δ7.39）和甲酸（for-mate，F(xiàn)OR，δ8.45）。見圖1。

圖1 2組小鼠血清典型的1H NMR譜

2.3 PLS-DA結(jié)果db/db小鼠和野生型小鼠的血清代謝模式在第一主成分上明顯分開（見圖2A），對應(yīng)的模式置換圖也顯示所建立的PLS-DA模型是可行的（見圖2B）。從相應(yīng)的載荷圖中可以看出LDL/VLDL、3-HB、LAC、ACA、PYU、GLI、CRE、CHO、TYR、HIS和PHE對2組的區(qū)分有較大的貢獻(xiàn)（見圖2C）。

2.4 代謝物定量分析 與野生型小鼠比，db/db小鼠血清中葡萄糖代謝相關(guān)的代謝物PYU、LAC、CIT降低，脂質(zhì)代謝相關(guān)代謝物L(fēng)DL/VLDL水平升高，3-HB和ACA水平降低，氨基酸代謝中，I/LEU水平升高，GLY、GLI、TYR和PHE水平降低，CRE和CHO水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 相關(guān)性分析 選擇了2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝物與UCr和UACR進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，僅在db/db小鼠中，血清CHO與UACR呈正相關(guān)（r=0.717，P＜0.05），GLI與UCr呈負(fù)相關(guān)（r=-0.737，P＜0.05）。見圖4。

3 討論

DN是臨床常見的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)病率高，是糖尿病致殘致死的主要原因之一[8]。由于缺乏早期的臨床特征，很多糖尿病患者無法得到有效的治療，很快出現(xiàn)間隙蛋白尿，進(jìn)而出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫和高血壓等癥狀，發(fā)生腎功能不全，出現(xiàn)尿毒癥和腎衰竭，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。db/db小鼠是由于4號染色體的瘦素受體基因發(fā)生突變所致的先天性肥胖的2型糖尿病模型，其糖尿病病程與人極為相似，是研究DN的理想模型[9]。

UACR是目前公認(rèn)的腎臟損傷和功能障礙的標(biāo)志物，也是臨床上診斷早期DN的一項敏感而可靠的指標(biāo)[10]。在17周時，db/db小鼠除了血糖這項經(jīng)典的糖尿病指征升高外，其UACR升高，UCR降低，說明其存在一定的腎損傷，且本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)第17周db/db小鼠的腎組織出現(xiàn)彌漫性系膜基質(zhì)擴張，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚等腎臟病理變化[11]，表明其已經(jīng)出現(xiàn)DN。

圖2 2組小鼠血清1H NMR圖譜的PLS-DA分析結(jié)果

圖3 2組小鼠血清代謝物比較

圖4 db/db小鼠血清代謝物的相關(guān)性分析

1H NMR檢測能同時獲得大量小分子代謝物信息，本研究中獲得的代謝物歸屬都基于我們前期的研究成果[12-13]，并且經(jīng)過2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗證。運用基于1H NMR的代謝組學(xué)結(jié)合相關(guān)性分析來探究db/db小鼠血清中的整體代謝改變，尋找與DN發(fā)生發(fā)展相關(guān)的代謝變化以及特定代謝調(diào)控途徑，分析DN潛在的生物標(biāo)志物，從代謝角度來推測DN的發(fā)病機制，為DN預(yù)測、診斷和治療提供有價值的依據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)db/db小鼠和野生型小鼠的血清代謝模式截然不同，并且篩選出了一系列對2組小鼠血清代謝模式區(qū)分貢獻(xiàn)較大的小分子代謝物。

葡萄糖代謝是維持機體生命活動能量的主要來源，包括葡萄糖有氧氧化和糖酵解。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，db/db小鼠血清中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物CIT下調(diào)，糖酵解的相關(guān)產(chǎn)物PYU和LAC也下調(diào)，表明這2個途徑均受到不同程度的抑制，這與STZ誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠的血清代謝輪廓[12]和DN GK鼠的結(jié)果相似[13]?？赡苁怯捎?型糖尿病存在胰島素抵抗，葡萄糖通過這2個途徑進(jìn)行分解供能的代謝途徑存在障礙，造成這2個代謝途徑紊亂。

DN存在一定的脂類代謝紊亂，血脂異常會加速腎臟病的進(jìn)展，其與腎功能迅速下降及進(jìn)展至需要腎臟替代治療密切相關(guān)[14]。血脂水平越高，脂質(zhì)就越容易在腎小球中沉積，腎小球的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，會形成泡沫細(xì)胞，使腎小球的硬化程度加重，進(jìn)而加重蛋白尿[15]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠血清中LDL/VLDL水平顯著高于野生型小鼠，DN的進(jìn)展可能與血脂代謝異常有關(guān)。ACA和3-HB是酮體的主要成分，也是肝內(nèi)線粒體脂肪酸β氧化的中間產(chǎn)物[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，db/db小鼠血清中ACA與3-HB水平顯著下降，表明在DN發(fā)生發(fā)展過程中脂肪酸β氧化代謝途徑可能發(fā)生了紊亂。這與王旭方等[17]發(fā)現(xiàn)的DN患者脂肪酸β氧化障礙結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)CHO與UACR呈正相關(guān)（r=0.717，P＜0.05），可能與DN腎損傷存在一定的相關(guān)性，可能是DN的潛在生物標(biāo)記物。CHO可通過二甲基甘氨酸轉(zhuǎn)化為肌酐，肌酐與腎功能密切相關(guān)；CHO也可被腸道微生物群分解成甲胺、二甲胺、三甲胺和氧化三甲胺，該類代謝物是體內(nèi)重要的滲透壓調(diào)節(jié)劑[18-19]。有多項研究表明三甲胺和氧化三甲胺是慢性腎病腎損傷的潛在生物標(biāo)記物[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠血清中GLI、GLY、TYR和HIS降低，說明糖尿病狀態(tài)下糖異生作用增強，這些氨基酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖途徑加強。作為血清中最為豐富的氨基酸，GLI是最重要的糖異生前體氨基酸，增加葡萄糖的生成[22]。有研究表明GLI能夠改善胰島素抵抗[23]，并能夠減輕膿毒癥引起的急性腎小管損傷[24]，在相關(guān)性分析中，GLI與UCr呈負(fù)相關(guān)（r=-0.737，P＜0.05），GLI可能也參與了DN。CRE能轉(zhuǎn)化為肌酐，而肌酐是評價腎小球率過濾的指標(biāo)，db/db小鼠血清中CRE下降，這可能與腎損傷引起血肌酐上升有關(guān)[25]。db/db小鼠血清中I/LEU升高，I/LEU是支鏈氨基酸，與其他氨基酸的代謝模式不同，是輔助合成肌肉的氨基酸[26]。本研究結(jié)果中I/LEU與UACR沒有相關(guān)性，但是其是血清中含量升高的氨基酸，有研究表明其可以作為預(yù)測糖尿病胰島素抵抗相關(guān)的生物標(biāo)記物[27]。

綜上所述，本研究運用基于1H NMR的代謝組學(xué)探究了db/db小鼠和野生型小鼠血清的代謝模式，發(fā)現(xiàn)2種小鼠血清的代謝模式截然不同，在DN發(fā)病過程中三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和脂類代謝途徑均受到不同程度抑制，糖異生作用增強，結(jié)合相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CHO可能是與DN相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物。

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