厭氧發(fā)酵液中微好氧功能菌的分離與鑒定

龔艷麗 李珊珊 李 寧 呂育財(cái) 郭金玲 龔大春 田毅紅

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院， 湖北 宜昌 443002; 2. 三峽大學(xué) 水利與環(huán)境學(xué)院， 湖北 宜昌 443002)

目前，隨著生物質(zhì)能的普遍利用，沼氣發(fā)酵技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物秸稈、高濃度有機(jī)廢水、餐廚垃圾、人畜糞便、污水處理廠剩余污泥等廢物的資源轉(zhuǎn)化處理，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益[1-2]．產(chǎn)甲烷菌在沼氣發(fā)酵、有機(jī)廢棄物處理以及全球大氣中的甲烷釋放等過(guò)程中扮演著重要的角色，它具有極強(qiáng)的抗菌能力，使傷寒桿菌、霍亂弧菌等致病菌難以生存，在消化處理期間將所有病原體和蟲卵幾乎殺死．

甲烷發(fā)酵研究已有一百多年的歷史，從19世紀(jì)末到20世紀(jì)初，許多國(guó)家的微生物學(xué)者對(duì)纖維素的發(fā)酵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下，纖維素和其他有機(jī)物發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣(主要成分為甲烷)，是微生物在其中起作用的結(jié)果．沼氣發(fā)酵所需要的環(huán)境是絕對(duì)厭氧，起主要作用的產(chǎn)甲烷菌屬于專性厭氧菌，它要求環(huán)境的氧化還原電位極低，最適氧化還原電位Eh為-330V[3]．產(chǎn)甲烷菌生活環(huán)境為極端環(huán)境，只能利用氫氣、二氧化碳、一氧化碳、甲酸、乙酸、甲醇及甲基胺等簡(jiǎn)單物質(zhì)產(chǎn)生甲烷和組成自身細(xì)胞物質(zhì)[4]．大部分不產(chǎn)甲烷菌為好氧菌，而大部分產(chǎn)甲烷菌為厭氧菌[5-6]．不產(chǎn)甲烷菌能將復(fù)雜的大分子有機(jī)物變成簡(jiǎn)單的小分子量的物質(zhì)．他們的種類繁多，依據(jù)其作用機(jī)制來(lái)分，有纖維分解菌，半纖維分解菌，淀粉分解菌，蛋白質(zhì)分解菌，脂肪分解菌和一些特殊的細(xì)菌，如產(chǎn)氫菌，產(chǎn)乙酸菌等．影響不產(chǎn)甲烷菌活性的因素很多，其中溫度的影響最大[7-9]．

由于長(zhǎng)期應(yīng)用的原因，對(duì)于糞便和高濃度有機(jī)廢水的厭氧消化處理中的產(chǎn)甲烷菌研究較多，所以加強(qiáng)對(duì)不產(chǎn)甲烷菌的研究很有必要[10]．而國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)甲烷菌的研究較多，對(duì)不產(chǎn)甲烷菌尚少報(bào)道，因此，本研究的最終目的就是希望獲得這種菌種，掌握它們的理化性質(zhì)，再將它們應(yīng)用于上述污水處理廠剩余污泥的厭氧消化、有機(jī)廢棄物堆肥或填埋的處理中時(shí)，可以通過(guò)已知知識(shí)控制工藝流程，提高甲烷發(fā)酵全過(guò)程的速率．可使上述的廢水處理不但可以順利進(jìn)行，而且在降低投資成本、節(jié)省運(yùn)行費(fèi)用、節(jié)約能源、提高處理效率等方面發(fā)揮積極的作用．

1 材料與方法

1.1 微好氧功能菌的分離和純化

菌種從本實(shí)驗(yàn)室高溫(55°C)沼氣發(fā)酵體系(發(fā)酵原料為蔬菜廢葉)中分離獲得，配制固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：分析天平(AR2140型梅特勒.托利多儀器有限公司)稱量牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂16 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH為7.0，置于立式滅菌鍋(上海申安LDZX-75KBS)中121℃滅菌30 min．取少量發(fā)酵液，用無(wú)菌水將其稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列濃度，充分搖勻．分別吸取0.5 mL于相應(yīng)稀釋濃度的培養(yǎng)皿內(nèi)，倒置于40℃恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗QHX-250BSH)內(nèi)培養(yǎng)24 h．然后將分離得到的菌種采用平板劃線法[11]進(jìn)行純化．

1.2 微好氧功能菌革蘭氏染色的測(cè)定

先用草酸銨結(jié)晶紫染色液初染，革蘭氏碘液媒染，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫色，番紅溶液復(fù)染，具體過(guò)程按說(shuō)明書操作．最后通過(guò)高倍電子顯微鏡觀察．

1.3 功能菌生長(zhǎng)繁殖最適溫度及pH的測(cè)定

菌種來(lái)源于上述分離純化所得的純化功能菌，采用液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基．實(shí)驗(yàn)的溫度梯度設(shè)計(jì)為30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，pH值梯度設(shè)計(jì)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5．將上述分離純化所得的純化功能菌分別接種于不同pH的培養(yǎng)基中，放在同一個(gè)溫度條件下培養(yǎng)．24 h后，用紫外分光光度計(jì)(北京瑞利UV-2601)測(cè)其OD600．

1.4 功能菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌種來(lái)源和培養(yǎng)基成分同1.1實(shí)驗(yàn)材料中的一致．培養(yǎng)條件：溫度為40℃，培養(yǎng)基的pH值為7.0．在超凈臺(tái)里，用滅菌過(guò)的250 mL錐形瓶各裝100 mL無(wú)菌水，用接種環(huán)從保存功能菌的斜面中挑取一環(huán)菌種，在100 mL的無(wú)菌水中混勻．用移液槍按1%(菌液體積比培養(yǎng)基體積)的接種量將菌液接種于滅菌過(guò)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，接種完成后置于振蕩器里，將溫度調(diào)至40℃振蕩培養(yǎng)．取樣周期為8 h一次[12-14]，每次取樣1 mL置于10 mL的離心管內(nèi)，加入9 mL的無(wú)菌水稀釋十倍，紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD600．

1.5 功能菌碳源耐受度的測(cè)定

采用液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，去掉原培養(yǎng)基中的牛肉膏，以外加碳源作為培養(yǎng)基的碳源．本實(shí)驗(yàn)按照單糖、雙糖及多糖設(shè)計(jì)，并考慮到實(shí)際生活中，甲烷發(fā)酵的對(duì)象是含有纖維素、淀粉、半纖維素等有機(jī)物，所以選擇D-阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維素、淀粉這6類碳源作為研究對(duì)象．6種碳源的質(zhì)量濃度梯度為5、10、15、20 g/L．在超凈臺(tái)里用3個(gè)滅菌過(guò)的250 mL錐形瓶各裝100 mL無(wú)菌水．用接種環(huán)從保存功能菌的斜面中挑取一環(huán)菌種，在100 mL的無(wú)菌水中混勻．用移液槍按1%(菌液體積比培養(yǎng)基體積)的接種量將菌液接種于滅菌過(guò)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，接種完成后置于振蕩器里，將溫度調(diào)至40℃振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后取樣．24 h后，取樣1 mL置于10 mL的離心管內(nèi)，加入9 mL的無(wú)菌水稀釋10倍，測(cè)其OD600．

1.6 功能菌的保藏和測(cè)序鑒定

固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基藥品同1.1分離材料一致,在固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基凝固前分裝于15個(gè)試管中，每株菌保存于5個(gè)斜面．分裝后將試管用棉塞密封好置于立式濕式滅菌器中滅菌30 min．將試管取出斜放，保證斜面高度在試管總高度的1/2～1/3之間．再用接種環(huán)挑取純化的菌株接種于斜面上，標(biāo)記后于4℃的冰箱中冷藏保存．細(xì)菌的活化采用液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從保存功能菌的斜面中挑取菌種接種于滅菌過(guò)的培養(yǎng)基中．接種完畢后置于振蕩器中40℃振蕩培養(yǎng)24 h，取樣、密封送至檢測(cè)中心測(cè)序．

2 結(jié)果與討論

2.1 微好氧功能菌分離、純化的變化

培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)基觀察，各個(gè)菌落的大小相當(dāng)理想，可以根據(jù)明顯的菌落特征判別不同菌株．同時(shí)說(shuō)明在后續(xù)試驗(yàn)里，培養(yǎng)周期采用24h是合理的．選擇每個(gè)梯度菌落分布均勻的培養(yǎng)皿進(jìn)行菌株分離．由圖1可得到4株菌落特征明顯不同的菌種，分別將這四株菌編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)．

如表1所示，通過(guò)對(duì)4株菌的菌落特征進(jìn)行比較：1號(hào)菌含水率較高，菌落大；2號(hào)菌的含水率最高，表面濕潤(rùn)光滑，但菌落??；3號(hào)菌表面濕潤(rùn)程度與1號(hào)菌類似，邊緣特征異于1號(hào)菌；4號(hào)菌是4株菌中含水率最低的，表面干燥．

表1 功能菌的純化結(jié)果

經(jīng)過(guò)6次純化，2號(hào)菌無(wú)法達(dá)到純化要求，因此將2號(hào)舍棄．如圖1所示，1號(hào)、3號(hào)和4號(hào)菌經(jīng)過(guò)純化實(shí)驗(yàn)后，純度極高，培養(yǎng)基內(nèi)的各個(gè)菌落形態(tài)特征一致．選擇單菌落，將其保存用于下面的實(shí)驗(yàn)研究．實(shí)驗(yàn)采用斜板保存法將3株菌保存，斜板保存的菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種來(lái)源，最后分別將斜板保存的菌株置于4℃冰箱中保存．

圖1 有效菌株純化

2.2 微好氧功能菌的革蘭氏染色變化

通過(guò)高倍電子顯微鏡觀察，如圖2所示，1號(hào)、3號(hào)和4號(hào)革蘭氏染色菌為紫色，說(shuō)明三株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌．

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖

2.3 功能菌生長(zhǎng)繁殖最適溫度及pH的變化

如圖3所示，1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)菌株的最適生長(zhǎng)溫度都為40℃，最適pH值都為7．

圖3 各功能菌最適溫度及pH

在溫度為30℃時(shí)，三株菌的數(shù)量均在pH為7.0達(dá)到峰值，但是1號(hào)菌在pH為7.0這個(gè)點(diǎn)上升速度極快，說(shuō)明在30℃時(shí)，pH的改變對(duì)1號(hào)菌生長(zhǎng)的影響較大．在溫度為35℃時(shí)，三株菌有一個(gè)共同點(diǎn)，在pH為6.5-7.0以及pH為8.5時(shí)，細(xì)菌數(shù)量變化幅度極大，這種陡變說(shuō)明在此溫度條件下，三株菌所需要的生長(zhǎng)環(huán)境是中性或弱堿性．在溫度為40℃時(shí)，1號(hào)菌和3號(hào)菌的pH變化曲線圖類似，在pH為7.0這個(gè)點(diǎn)出現(xiàn)峰值，細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)速度快；4號(hào)菌在此溫度條件下，pH值對(duì)4號(hào)菌的影響力要?。跍囟葹?5℃時(shí)，隨著pH值變化，1號(hào)菌的數(shù)量變化速度平緩，pH所造成的影響不大；3號(hào)菌在7.0～7.5之間，數(shù)量增長(zhǎng)相當(dāng)，說(shuō)明在此溫度下，3號(hào)菌在中性或偏弱堿性適宜生長(zhǎng)；4號(hào)菌在pH大于7.0時(shí)，數(shù)量明顯下降，說(shuō)明45℃時(shí)，4號(hào)菌在弱酸性或者中性適宜生長(zhǎng)．在溫度為50℃時(shí)，1號(hào)菌、3號(hào)菌和4號(hào)菌在pH為8.5這個(gè)點(diǎn)基本停止生長(zhǎng)，說(shuō)明在50℃、pH=8.5這個(gè)條件下，對(duì)三株菌新陳代謝、生長(zhǎng)繁殖有了極強(qiáng)的抑制作用．

2.4 功能菌生長(zhǎng)曲線的變化

理論上細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線一般分為適應(yīng)期、加速期、對(duì)數(shù)期、減速期、靜止期、衰亡期6個(gè)時(shí)期，按照這6個(gè)時(shí)期對(duì)三株菌的生長(zhǎng)曲線做如下分析．

由圖4可知，1號(hào)菌、3號(hào)菌和4號(hào)菌的靜止期相同，都是在0～8 h時(shí)段，細(xì)菌數(shù)量變化不大．根據(jù)0時(shí)刻的數(shù)據(jù)顯示，三株菌的接種量幾乎一致，隨著時(shí)間的推移，1號(hào)菌的生長(zhǎng)繁殖速率比3號(hào)菌和4號(hào)菌快，達(dá)到穩(wěn)定后，1號(hào)菌的數(shù)量峰值明顯高于其他兩株菌．4號(hào)菌的數(shù)量峰值最小，但是峰值出現(xiàn)最快，在16～24 h時(shí)段就出現(xiàn)了，其次是1號(hào)菌，4號(hào)菌在32～40 h時(shí)段才出現(xiàn)峰值，但細(xì)菌總量高于4號(hào)菌低于1號(hào)菌．靜止期出現(xiàn)后，三株菌均出現(xiàn)衰減，1號(hào)菌衰減量很少，并且在40 h點(diǎn)以后達(dá)到穩(wěn)定；3號(hào)菌的衰減速度是最快的，但細(xì)菌總量仍高于4號(hào)菌低于1號(hào)菌；4號(hào)菌在24～32 h衰減速率較快，而后期衰減速率平緩；衰減穩(wěn)定后，1號(hào)菌的細(xì)菌總量最高，3號(hào)菌次之，4號(hào)菌最低．通過(guò)比較，1號(hào)菌的生長(zhǎng)繁殖能力最強(qiáng)且存活率最高；3號(hào)菌的生長(zhǎng)周期最長(zhǎng)但衰減速率最快；4號(hào)菌的數(shù)量峰值最早出現(xiàn)但生長(zhǎng)繁殖能力弱于其他兩株菌．

圖4 各功能菌的生長(zhǎng)曲線比較

2.5 功能菌碳源耐受度的變化

當(dāng)以D-阿拉伯糖作為外加碳源時(shí)，對(duì)于1號(hào)菌，最適生長(zhǎng)的D-阿拉伯糖是15 g/L，但整體觀察可得，D-阿拉伯糖的濃度變化對(duì)1號(hào)菌生長(zhǎng)影響不大．3號(hào)菌最適生長(zhǎng)D-阿拉伯糖濃度是15 g/L．對(duì)于4號(hào)菌，20 g/L條件下最高，說(shuō)明高濃度的D-阿拉伯糖對(duì)4號(hào)菌的生長(zhǎng)抑制不明顯．當(dāng)以葡萄糖作為外加碳源時(shí)，1號(hào)菌最適葡萄糖濃度為10 g/L，3號(hào)菌最適生長(zhǎng)的葡萄糖濃度為10 g/L．4號(hào)菌最適葡萄糖濃度為15 g/L．當(dāng)以乳糖作為外加碳源時(shí)，1號(hào)菌和4號(hào)菌適合在高濃度乳糖環(huán)境生長(zhǎng)．3號(hào)菌最適生長(zhǎng)的乳糖濃度范圍在10～15 g/L之間．當(dāng)以麥芽糖作為外加碳源時(shí)，1號(hào)菌最適生長(zhǎng)的麥芽糖濃度是10 g/L．當(dāng)麥芽糖濃度大于15 g/L時(shí)，細(xì)菌數(shù)量大致相同，說(shuō)明在1號(hào)菌對(duì)高濃度麥芽糖的分解利用率低．3號(hào)菌是適合在較高濃度的麥芽糖環(huán)境中生長(zhǎng)．對(duì)于4號(hào)菌麥芽糖的濃度變化對(duì)4號(hào)菌的影響不大，說(shuō)明在分解麥芽糖的過(guò)程中，4號(hào)菌可以以麥芽糖作為碳源，但利用率不高．當(dāng)以纖維素作為外加碳源時(shí)，1號(hào)菌對(duì)纖維素利用分解能力比較弱，低濃度纖維素環(huán)境適合1號(hào)菌生長(zhǎng)繁殖．3號(hào)菌的最適生長(zhǎng)纖維素濃度是10 g/L．高濃度纖維素環(huán)境對(duì)3號(hào)菌的生長(zhǎng)繁殖有極大的抑制作用．4號(hào)菌的數(shù)量受纖維素濃度影響?。?dāng)以淀粉作為外加碳源時(shí)，1號(hào)菌生長(zhǎng)速度與淀粉溶液濃度呈正相關(guān)．3號(hào)菌與1號(hào)菌類似，其生長(zhǎng)速度與淀粉溶液濃度呈正相關(guān)．當(dāng)?shù)矸蹪舛仍?～10 g/L之間時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速度明顯高于纖維素濃度在10～20 g/L之間時(shí)的生長(zhǎng)速度，說(shuō)明淀粉濃度的提高對(duì)3號(hào)菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用．由4號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線可得最適生長(zhǎng)淀粉濃度為15 g/L．雖然4號(hào)菌適于在高濃度淀粉條件下生長(zhǎng)，但是當(dāng)?shù)矸蹪舛冗^(guò)高時(shí)，對(duì)4號(hào)菌的生長(zhǎng)仍有抑制作用．

圖5 最適生長(zhǎng)碳源濃度

2.6 功能菌的測(cè)序鑒定

對(duì)3株菌進(jìn)行測(cè)序，其中1號(hào)菌由于取樣配送過(guò)程中處理不當(dāng)，導(dǎo)致純度達(dá)不到測(cè)序要求，無(wú)法測(cè)得1號(hào)菌的類型．對(duì)3號(hào)和4號(hào)菌的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2．

表2 3號(hào)和4號(hào)菌株相似度比對(duì)

圖6 3、4號(hào)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，3號(hào)菌和4號(hào)菌均為芽孢桿菌屬．芽孢桿菌屬是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)菌，好氧或兼性厭氧生活．根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版中的芽孢桿菌的分類概況，列數(shù)了48種芽孢桿菌，其中有26個(gè)沒(méi)有得到廣泛認(rèn)可[15]．3號(hào)菌與已知的芽孢桿菌的基因相似度達(dá)到100%，4號(hào)菌與已知的芽孢桿菌的基因相似度達(dá)到99%．如圖，雖然3號(hào)菌和4號(hào)菌的相似度極高，在分析系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)將兩株菌分在了同一分支上．但根據(jù)對(duì)3號(hào)菌和4號(hào)菌理化性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3號(hào)菌和4號(hào)菌存在一定的差異．

16S rRNA測(cè)序鑒定的最小單位是屬，比屬小的分類單位有亞屬、種、亞種，所以需要更先進(jìn)的技術(shù)來(lái)判斷3號(hào)菌和4號(hào)菌的關(guān)系．

3 結(jié) 論

1)實(shí)驗(yàn)初期分離得到4株菌，分別為1號(hào)菌、2號(hào)菌、3號(hào)菌、4號(hào)菌，在純化實(shí)驗(yàn)階段，由于2號(hào)菌無(wú)法達(dá)到我們預(yù)想的純度，所以選擇舍棄．后期實(shí)驗(yàn)主要對(duì)1號(hào)菌、3號(hào)菌及4號(hào)菌的理化性質(zhì)進(jìn)行研究．

2)理化性質(zhì)主要研究?jī)?nèi)容是革蘭氏染色、最適生長(zhǎng)溫度及pH、生長(zhǎng)曲線．三株菌的革蘭氏染色的顯色結(jié)果均為紫色，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌．三株菌的最適生長(zhǎng)溫度是40℃，最適生長(zhǎng)pH值為7．通過(guò)生長(zhǎng)曲線圖觀察到，1號(hào)菌的生長(zhǎng)周期為2 d，3號(hào)菌的生長(zhǎng)周期為2 d，4號(hào)菌的生長(zhǎng)周期為1 d．

3)探究功能菌的最適生長(zhǎng)碳源濃度，所選碳源為D-阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維素及淀粉．對(duì)于6類碳源，不同濃度條件下,不同菌株的生長(zhǎng)情況也有極大區(qū)別，三株菌的相似之處是對(duì)于以淀粉的分解利用率極高，對(duì)于麥芽糖的分離利用率低．

4)最后將三株菌送至上海檢測(cè)中心測(cè)序．三株菌中，1號(hào)菌由于取樣操作處理的不當(dāng)，導(dǎo)致純度不夠，無(wú)法進(jìn)行提取DNA進(jìn)行測(cè)序；3號(hào)菌和4號(hào)菌經(jīng)過(guò)測(cè)序，鑒定為芽孢桿菌屬．

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