禽源多殺性巴氏桿菌毒力基因多重PCR檢測方法的建立

何賢發(fā),馮方東，徐一凡，高 博，施文文，薛夢琦，郭偉娜

(安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種條件致病菌，能夠引起多種動物疾病，包括禽霍亂、豬肺疫和萎縮性鼻炎、牛和家兔出血性敗血癥等，對全世界畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。特別是在外界應(yīng)激條件下，比如氣候突變、長途運輸、寄生蟲感染、營養(yǎng)不良等均可能導(dǎo)致機體抵抗力下降，從而發(fā)生多殺性巴氏桿菌的內(nèi)源性或外源性感染[2]。根據(jù)莢膜抗原的不同，多殺性巴氏桿菌主要分為5個血清型(A、B、D、E、F)[3]，其中A血清型主要感染禽類，而B血清型和E血清型與出血性敗血癥有關(guān)，D血清型主要引起豬傳染性萎縮性鼻炎。莢膜不僅是血清型分型的依據(jù)，還是多殺性巴氏桿菌一種重要的毒力因子，其他毒力因子還包括脂多糖、皮膚壞死毒素及外膜蛋白等。

研究發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌的莢膜和外膜蛋白還具有一定的免疫原性，如外膜蛋白H不僅能與宿主細胞受體相互作用，在感染的起始階段介導(dǎo)細菌黏附到宿主細胞，而且還是宿主免疫系統(tǒng)重要的靶位點[4]。因此，這些毒力基因的檢測對研究多殺性巴氏桿菌致病機制及疫苗研發(fā)均具有重要意義。目前，對禽源多殺性巴氏桿菌毒力基因方面的研究較少，并且已有的常規(guī)PCR方法每次只能檢測單個基因，繁瑣費時。多重PCR方法不僅具有普通PCR的高特異性和敏感性等優(yōu)點，還能同時擴增多個基因片段，快速準確，已用于多種病原的鑒定[5-6]或同種病原多個基因的檢測[7-8]。因此，本研究主要是建立一種針對禽源多殺性巴氏桿菌毒力基因的多重PCR方法，為其毒力基因的快速檢測及致病機制研究奠定基礎(chǔ)，也為進一步篩選保護性抗原及疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雞源多殺性巴氏桿菌分離株HN-1和CZ-6、番鴨源多殺性巴氏桿菌分離株MD-1(A血清型)、仔豬黃痢大腸埃希菌、雞白痢沙門菌分離株，均由安徽科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗室分離保存；PCR擴增試劑盒、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、DNA Marker DL 1 500等，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考文獻[9]中的多殺性巴氏桿菌9個毒力基因引物序列，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成引物。

1.2.2 毒力基因的PCR擴增及敏感性測定 以番鴨源多殺性巴氏桿菌分離株MD-1株為目的菌，煮沸法提取核酸，并用NanoDrop One超微量紫外分光光度計測定核酸濃度，然后用滅菌水進行10倍系列稀釋，分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4等濃度，測定單個毒力基因PCR擴增的敏感性。反應(yīng)體系25 μL：模板2 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，滅菌水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進行測序，測序結(jié)果進行BLAST比對分析。

1.2.3 毒力基因多重PCR擴增及優(yōu)化 將9個毒力基因分5組分別對多殺性巴氏桿菌分離株MD-1進行多重PCR擴增，多重PCR體系1為檢測pfhA、oma87和ompH基因，多重PCR體系2為檢測hgbB、hgbA和exBD-tonB基因，多重PCR體系3為檢測sodC、sodA和nanB基因，多重PCR體系4為檢測pfhA和nanB基因，多重PCR體系5為檢測sodC、sodA、oma87和ompH基因。

反應(yīng)體系先按照1.2.2進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果適當調(diào)整引物濃度，擴增較強的基因降低引物用量至0.25 μL、0.5 μL，擴增較弱的基因增加引物用量至1.25 μL、1.5 μL。反應(yīng)條件同1.2.2。

1.2.4 毒力基因多重PCR方法特異性的測定 采用優(yōu)化后的多重PCR方法分別對雞源多殺性巴氏桿菌分離株HN-1和CZ-6，以及仔豬黃痢大腸埃希菌、雞白痢沙門菌分離株進行毒力基因檢測，同時以滅菌水作為陰性對照。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 毒力基因多重PCR方法敏感性的測定 多殺性巴氏桿菌分離株MD-1的核酸分別進行10-1、10-2、10-3、10-4系列倍比稀釋后，各取2 μL作為模板，采用多重PCR方法進行毒力基因檢測，以滅菌水作為陰性對照。

1.2.6 毒力基因多重PCR方法重復(fù)性的測定 采用多重PCR方法對不同稀釋度的多殺性巴氏桿菌分離株MD-1的核酸分別在不同時間進行3次重復(fù)性檢測。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因的PCR擴增及敏感性測定結(jié)果

多殺性巴氏桿菌MD-1分離株的核酸用超微量紫外分光光度計測定，濃度為1.81×108copies/μL。該菌株毒力基因的PCR擴增結(jié)果表明，9個毒力基因均能擴增出與預(yù)期大小相符的目的條帶(圖1)，PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，均與禽源多殺性巴氏桿菌相應(yīng)毒力基因序列相符。

將多殺性巴氏桿菌MD-1分離株的核酸分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4等濃度，然后測定9個毒力基因PCR擴增的敏感性，結(jié)果見圖2。當模板稀釋為10-1、10-2時，均可見目的條帶，但稀釋至10-3時，即為1.81×105copies/μL，pfhA和sodC目的基因條帶不明顯；在稀釋為10-4濃度，即1.81×104copies/μL時，pfhA和sodC目的基因沒有條帶，exBD-tonB目的基因有較弱條帶，而其他6個毒力目的基因條帶明顯。

M.DNA標準DL 1 500；1～9.分別為pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；10～18.分別為pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的陰性對照

M.DNA Marker DL 1 500；1-9.PCR products of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively; 10-18.Negative controls of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively

圖1毒力基因PCR擴增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification results of virulence genes

M.DNA標準DL 1 500；1～9,10～18,19～27,28～36.分別為模板為10-1,10-2,10-3,10-4稀釋時，pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；37～45.分別為pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的陰性對照

M.DNA Marker 1 500; 1-9,10-18,19-27,28-36.PCR products of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH amplified for templates diluted as 10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 37-45.Negative controls of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively

圖2毒力基因PCR擴增的敏感性測定結(jié)果

Fig.2 Sensitivity test results of PCR amplification for virulence genes

2.2 多重PCR擴增及優(yōu)化結(jié)果

多重PCR擴增時反應(yīng)體系中的上、下游引物用量經(jīng)調(diào)整優(yōu)化后分別為：pfhA基因1.5 μL，sodC和hgbB基因為0.5 μL，exBD-tonB基因為0.25 μL，其余5個基因均為1 μL，可有效擴增出所有目的條帶。

9個毒力基因5種多重PCR體系的擴增結(jié)果見圖3。由圖3可知，多重PCR體系1、3、4、5擴增效果較好，如pfhA、oma87和ompH基因，sodC、sodA和nanB基因組成的3重PCR，pfhA和nanB基因組成的雙重PCR，sodC、sodA、oma87和ompH基因組成的4重PCR，均能檢測出多種毒力基因，但多重PCR體系2中有非特異性條帶，因此選用多重PCR體系1、3、4、5進行特異性和敏感性檢測。

2.3 多重PCR方法特異性測定結(jié)果

多重PCR體系1、3、4、5對多殺性巴氏桿菌分離株HN-1、CZ-6，以及仔豬黃痢大腸埃希菌、雞白痢沙門菌分離株的PCR擴增結(jié)果分別見圖4。由圖4可知，2株禽源多殺性巴氏桿菌均擴增出相應(yīng)的毒力基因，目的條帶大小相符；大腸埃希菌和沙門菌分離株沒有擴增出條帶，表明本研究所建立的4種多重PCR體系特異性較強。

2.4 多重PCR方法敏感性測定結(jié)果

多殺性巴氏桿菌分離株MD-1毒力基因多重PCR體系1、3、4、5的敏感性測定結(jié)果見圖5。由圖5可知，多重PCR體系1、3、4的檢測敏感性為10-2，即1.81×106copies/μL的核酸，多重PCR體系5甚至可檢測至10-3，即1.81×105copies/μL的核酸。毒力基因4種多重PCR體系與單個毒力基因PCR檢測的敏感性均一致。

M.DNA標準DL 1 500；1～3.分別為pfhA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；6～8.分別為hgbB、hgbA、exBD-tonB基因的PCR產(chǎn)物；11～13.分別為sodC、sodA和nanB基因的PCR產(chǎn)物；16～17.分別為pfhA和nanB基因的PCR產(chǎn)物；20～23.分別為sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR產(chǎn)物；4、9、14、18、24.分別為多重PCR體系1、2、3、4、5的PCR產(chǎn)物；5、10、15、19、25.分別為多重PCR體系1、2、3、4、5的陰性對照

M.DNA Marker DL 1 500；1-3.PCR products of pfhA,oma87 and ompH genes,respectively; 6-8.PCR products of hgbB,hgbA and exBD-tonB genes,respectively; 11-13.PCR products of sodC,sodA and nanB genes,respectively; 16-17.PCR products of pfhA and nanB genes,respectively; 20-23.PCR products of sodC,sodA,oma87 and ompH genes,respectively; 4,9,14,18,24.Products of multiplex PCR 1,2,3,4 and 5,respecitively; 5,10,15,19,25.Negative control of multiplex PCR 1,2,3,4 and 5,respecitively

圖3毒力基因的多重PCR擴增結(jié)果

Fig.3 Multiplex PCR amplification results of virulence genes

M.DNA標準DL 1 500；1、6、11、16.分別為菌株HN-1多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；2、7、12、17.分別為菌株CZ-6多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；3、8、13、18.分別為仔豬黃痢大腸埃希菌多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；4、9、14、19.分別為雞白痢沙門菌多重PCR體系1、3、4、5的PCR產(chǎn)物；5、10、15、20.分別為多重PCR體系1、3、4、5的陰性對照

M.DNA Marker DL 1 500; 1,6,11,16.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 of strain HN-1,respectively; 2,7,12,17.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 of strain CZ-6,respectively; 3,8,13,18.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 forE.colifrom piglets with yellow scour,respectively; 4,9,14,19.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 forSalmonellapullorum,respectively; 5,10,15,20.Negative control of multiplex PCR 1,3,4 and 5,respectively

圖4多重PCR方法的特異性檢測結(jié)果

Fig.4 Specificity test results of multiplex PCR assay

2.5 多重PCR方法重復(fù)性測定結(jié)果

采用多重PCR體系1、3、4、5分別對不同稀釋度的模板在不同時間進行了3次PCR擴增，結(jié)果均一致(圖略)，表明建立的多重PCR方法重復(fù)性較好。

3 討論

近年來，多殺性巴氏桿菌毒力因子方面的研究較多，主要包括黏附素和定殖因子、鐵離子調(diào)節(jié)和攝取蛋白、唾液酸酶、透明質(zhì)酸酶、超氧化物歧化酶、毒素、脂多糖、莢膜及多種外膜蛋白等。Tang Xi-biao等[10]和Furian T Q等[11]對豬源和禽源多殺性巴氏桿菌中毒力基因的檢測發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白、黏附素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、唾液酸酶和超氧化物歧化酶等16個毒力相關(guān)基因的檢出率均高于90%；Varga Z等[12]對42株鵝源多殺性巴氏桿菌毒力基因的檢測發(fā)現(xiàn)，鐵攝取蛋白相關(guān)基因(hgbA，hgbB)存在于所有菌株，而唾液酸酶基因(nanH、nanB)僅在部分菌株檢出；Furian T Q等[13]對禽霍亂病例中分離的25株多殺性巴氏桿菌毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，ompH、oma87、sodC、hgbA、hgbB和nanB等基因的檢出率均為100%，pfhA和sodA基因的檢出率分別為60%和96%；Khamesipour F等[14]對30株牛源多殺性巴氏桿菌的毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，23個毒力基因在肺炎肺臟中的分離株中均被檢出，但健康肺臟中的分離株只檢出16個毒力基因。研究發(fā)現(xiàn)[15]，多殺性巴氏桿菌中毒力基因的分布與牛感染后的臨床表現(xiàn)有較強地正相關(guān)性。由此可知，不同宿主和血清型的多殺性巴氏桿菌中毒力基因的存在情況均會影響其致病性，因此，毒力基因的檢測對多殺性巴氏桿菌致病機制的研究極其重要。

M.DNA標準DL 1 500；1～5.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時，多重PCR體系1的PCR產(chǎn)物；7～11.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時，多重PCR體系3的PCR產(chǎn)物；13～17.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時，多重PCR體系4的PCR產(chǎn)物；19～23.模板分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4時，多重PCR體系5的PCR產(chǎn)物；6、12、18、24.分別為多重PCR體系1、3、4、5的陰性對照

M.DNA Marker DL 1 500; 1-5.PCR products of multiplex PCR 1 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 7-11.PCR products of multiplex PCR 3 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 13-17.PCR products of multiplex PCR 4 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 19-23.PCR products of multiplex PCR 5 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 6,12,18,24.Negative controls of multiplex PCR 1,3,4 and 5,respectively

圖5多重PCR方法的敏感性測定結(jié)果

Fig.5 Sensitivity test results of multiplex PCR assay

多重PCR方法的優(yōu)勢是能夠快速、準確地同時檢測多個基因，提高檢測效率，節(jié)省檢測時間，成本低廉，有較強的實踐應(yīng)用價值。目前，已有多種多重PCR方法用于多種病原[5-6]或多個基因[7-8]的檢測，但用于多殺性巴氏桿菌毒力基因方面的研究較少，除用于莢膜分型外[16]，對其他毒力基因檢測方面的報道更少。Furian T Q等[13]建立了3種多重PCR體系用于多殺性巴氏桿菌毒力基因的檢測，但均不能檢測ompH基因，而本研究建立的多重PCR體系1和5均可檢測該基因。本研究主要是對禽源多殺性巴氏桿菌分離株的9個毒力基因進行PCR檢測，最終篩選出4種多重PCR體系用于其中6個毒力基因的檢測(pfhA、nanB、ompH、oma87、sodA和sodC)，根據(jù)多重PCR體系1、3或多重PCR體系4、5均可檢測出這6個基因，并且這些多重PCR方法特異性強，敏感性較高，4種多重PCR體系均可檢測至1.81×106copies/μL的核酸，具有可重復(fù)性。本研究建立的多重PCR方法有利于禽源多殺性巴氏桿菌中毒力基因的快速檢測，從而為其致病機制的研究奠定基礎(chǔ)，也為其保護性抗原的篩選和疫苗研制提供參考。

參考文獻：

[1] Ghaffar A,Tariq A.In-silico analysis ofPasteurellamultocidato identify common epitopes between fowl,goat and buffalo[J].Gene,2016,580(1):58-66.

[2] Wilson B A,Ho M.Pasteurellamultocida:from zoonosis to cellular microbiology[J].Clin Microbiol Rev,2013,26(3):631-655.

[3] Carter G R.Studies onPasteurellamultocida.I.A hemagglutination test for the identification of serological types[J].Am J Vet Res,1995,16(60):481-484.

[4] Hatfaludi T,Alhasani K,Boyce J D,et al.Outer membrane proteins ofPasteurellamultocida[J].Vet Microbiol,2010,144(1-2):1-17.

[5] 許國洋,付利芝,楊金龍,等.山羊淋巴結(jié)炎病原菌的分離鑒定及多重PCR檢測方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2017,48(2):324-330.

[6] 胡茂秀,王莎莎,俞 超.雞糞中沙門氏菌和大腸桿菌O78多重PCR檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2016,38(1):58-62.

[7] 丁云竹,孫冰清,姜 盼,等.鴨疫里默氏桿菌16S rRNA和dnaB基因的雙重PCR檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2017,39(1):50-53.

[8] 孟相秋,袁超文,劉文鑫,等.大腸桿菌腸毒素基因多重PCR檢測方法的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報,2015,31(1):6-10.

[9] 郭偉娜,路振香,劉利曉,等.雞源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其毒力基因的檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2017,47(7):890-896.

[10] Tang Xibiao,Zhao Zhanqin,Hu Junyong,et al.Isolation,antimicrobial resistance,and virulence genes ofPasteurellamultocidastrains from swine in China[J].J Clin Microbiol,2009,47(4):951-958.

[11] Furian T Q,Borges K A,Laviniki V,et al.Virulence genes and antimicrobial resistance ofPasteurellamultocidaisolated from poultry and swine[J].Braz J Microbiol,2016,47(1):210-216.

[12] Varga Z,Volokhov D V,Stipkovits L,et al.Characterization ofPasteurellamultocidastrains isolated from geese[J].Vet Microbiol,2013,163(1-2):149-156.

[13] Furian T Q,Borges K A,Rocha S L S,et al.Detection of virulence-associated genes ofPasteurellamultocidaisolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR[J].Pesq Vet Bras,2013,33(2):177-182.

[14] Khamesipour F,Momtaz H,Azhdary M M.Occurrence of virulence factors and antimicrobial resistance inPasteurellamultocidastrains isolated from slaughter cattle in Iran[J].Front Microbiol,2014,5:536. doi: 10.3389/fmicb.2014.00536. eCollection 2014.

[15] Katsuda K,Hoshinoo K,Ueno Y,et al.Virulence genes and antimicrobial susceptibility inPasteurellamultocidaisolates from calves[J].Vet Microbiol,2013,167(3-4):737-741.

[16] Townsend K M,Boyce J D,Chung J Y,et al.Genetic organization ofPasteurellamultocidacap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].J Clin Microbiol,2001,39(3):924-929.