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    提高生物樣品電鏡圖像反差的幾點體會

    2018-05-21 07:40:06劉湘花張俊霞王會麗李曉冰
    實驗室研究與探索 2018年3期
    關(guān)鍵詞:透射電鏡染液電鏡

    劉湘花, 張俊霞, 王會麗, 李曉冰

    (河南中醫(yī)藥大學(xué) a.病理實驗中心;b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046)

    0 引 言

    電鏡最突出的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在其具有很高的分辨率,適用于各種研究樣品的需要,在生物學(xué)研究領(lǐng)域中是其他儀器所無法取代的[1]。在電子顯微技術(shù)中,生物樣品需要用重金屬鹽類浸染,使樣品中各種細(xì)胞器或大分子吸附不同數(shù)量的重金屬原子,以增加樣品內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的電子密度,增加圖像反差 。由于生物體組織和細(xì)胞成分主要是由C、H、O、N等輕元素組成,這些原子序數(shù)低,對電子的散射能力較弱,相互之間的差別很小,且制作超薄切片時通常把生物樣品包埋在環(huán)氧樹脂[2]中,這些聚合樹脂也多為輕元素組成,這樣會造成樣品與包埋劑兩者質(zhì)量厚度差異很小。由于以上原因,生物樣品本身的固有反差很弱。因此,必須采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邎D像的反差,本實驗室在制樣處理和電鏡操作技術(shù)方面積累了一些增加圖像反差的經(jīng)驗。

    1 傳統(tǒng)染色方法的改良

    傳統(tǒng)的染色方法是采用醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛雙染法[3]。本實驗室采用“漂浮式滴染法”[4],電鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清晰、無污染。但樣品用戊二醛固定時間過長,用此方法染色后,細(xì)胞結(jié)構(gòu)反差不夠理想,這時可再重復(fù)鈾染(10 min)鉛染(5 min)1次,能明顯提高樣本反差(見圖1、2)。

    圖1 傳統(tǒng)方法染色,線粒體結(jié)構(gòu)顯示模糊

    圖2 改良方法染色,線粒體結(jié)構(gòu)明顯清晰

    在重金屬鹽染色過程中,容易出現(xiàn)染色效果欠佳,分析其原因及克服方法:①標(biāo)本本身前固定處理不好,標(biāo)本體積過大,取材時間過長,取材環(huán)境溫度過高等。 因此標(biāo)本體積盡可能地小(1 mm×1 mm×1 mm),快速取材,降低取材環(huán)境溫度;②后固定時鋨酸沒有完全滲透固定,主要是標(biāo)本體積過大所致,在不影響研究結(jié)果的前提下越小越好[5];③染液pH的影響,一般醋酸鈾pH值為4.5,檸檬酸鉛pH為12,效果較好;④水洗工具的改進(jìn)。傳統(tǒng)的水洗是用燒杯裝有雙蒸水水洗,本實驗室為避免鉛污染,用封口膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的燒杯水洗,水洗時間30 min。本實驗室采用注射器,把注射器的尖頭磨平后用細(xì)流水反復(fù)沖洗銅網(wǎng)的正反面約2 min,大大縮短了水洗時間,且操作簡單,沒有污染;⑤樣品結(jié)構(gòu)反差強弱,與染液溫度有關(guān),當(dāng)染液從4 ℃冰箱中取出后,不要立刻進(jìn)行染色,而應(yīng)將染液在室溫中放置一段時間,使染液溫度達(dá)到室溫,否則即使增加染色時間,也不能獲得良好反差。

    2 重金屬投影噴鍍

    本實驗室采用掃描電鏡的噴鍍技術(shù)[6],具體方法是在樣本鈾染和鉛染后,在生物樣品表面再噴涂一層碳離子,能明顯提高圖像反差,組織微細(xì)結(jié)構(gòu)分辨率明顯提高。解決了高分辨率和增加反差之間的矛盾。

    3 碳膜代替方華膜撈片

    一般撈片都用方華膜[7]或者裸網(wǎng)撈片。方華膜在電子束的照射下容易產(chǎn)生漂移,甚至使膜破碎,損壞被觀察樣品。本實驗室采用碳膜撈片。與其他制膜材料比較,碳的密度較高,散射能力較強,碳膜的機械強度、親水性及其熱穩(wěn)定性都優(yōu)于其他種類的支持膜,進(jìn)而可減少樣品的熱漂移,增加樣品的穩(wěn)定性[8-9]。碳膜在高分辨率觀察時使用,其厚度在2~10 nm,其缺點是易碎,制好的碳膜不易長久保存。

    4 樣品切片厚度對圖像反差的影響

    生物超薄切片厚度為50~100 nm,切片越薄越利于電子束的透過,且散射電子少,成像的亮度大,色差小,分辨率高[10-11]。但過薄的切片,由于其質(zhì)量厚度太小,成像的反差反而較弱,不利于觀察。所以,通常在保證一定分辨率的前提下,選擇適當(dāng)?shù)那衅穸?75 nm),可以增加圖像的反差。

    5 選擇小孔徑光闌

    物鏡光闌孔徑越小,圖像反差越大[12]。但反差的提高并不與光闌的大小成正比,當(dāng)光闌過小時,會造成圖像亮度過暗,容易產(chǎn)生污染或散射。所以在物鏡光闌的選擇時,應(yīng)兼顧其他的成像因素[13-14]。

    6 降低加速電壓

    電子散射角度的大小與加速電壓的平方成反比,降低電子加速電壓可以提高圖像的反差[15]。但加速電壓降低時,低速電子波易受雜散電磁場干擾,同時電子的穿透力低,色差增大,最終會造成分辨率的降低。

    7 正確的欠焦

    在電鏡觀察樣品時,樣品質(zhì)量厚度迅速改變區(qū)域所對應(yīng)的圖像上會出現(xiàn)費涅爾衍射環(huán)。當(dāng)物鏡過焦時,費涅爾條紋成暗線,欠焦時則呈現(xiàn)亮線;在正焦時,費涅爾條紋消失【4】。樣品要求電鏡高倍率觀察時,利用費涅爾衍射環(huán)來增加圖像反差,選擇適當(dāng)?shù)那方沽?,可獲得最好的圖像反差,但欠焦量不宜過大。通常不能用過焦的方式來提高反差。

    8 結(jié) 語

    影響生物電鏡圖像反差的因素很多,圖像的反差除與樣品本身密度和厚度有關(guān),還與電子顯微鏡的工

    作條件有關(guān),只有注意到以上每個實驗操作環(huán)節(jié),才能得到較滿意的圖像反差效果。

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