提高生物樣品電鏡圖像反差的幾點體會

劉湘花, 張俊霞, 王會麗, 李曉冰

(河南中醫(yī)藥大學(xué) a.病理實驗中心；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

0 引 言

電鏡最突出的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在其具有很高的分辨率，適用于各種研究樣品的需要，在生物學(xué)研究領(lǐng)域中是其他儀器所無法取代的[1]。在電子顯微技術(shù)中，生物樣品需要用重金屬鹽類浸染，使樣品中各種細(xì)胞器或大分子吸附不同數(shù)量的重金屬原子，以增加樣品內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的電子密度，增加圖像反差 。由于生物體組織和細(xì)胞成分主要是由C、H、O、N等輕元素組成，這些原子序數(shù)低，對電子的散射能力較弱，相互之間的差別很小，且制作超薄切片時通常把生物樣品包埋在環(huán)氧樹脂[2]中，這些聚合樹脂也多為輕元素組成，這樣會造成樣品與包埋劑兩者質(zhì)量厚度差異很小。由于以上原因，生物樣品本身的固有反差很弱。因此，必須采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邎D像的反差，本實驗室在制樣處理和電鏡操作技術(shù)方面積累了一些增加圖像反差的經(jīng)驗。

1 傳統(tǒng)染色方法的改良

傳統(tǒng)的染色方法是采用醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛雙染法[3]。本實驗室采用“漂浮式滴染法”[4]，電鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清晰、無污染。但樣品用戊二醛固定時間過長，用此方法染色后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)反差不夠理想，這時可再重復(fù)鈾染(10 min)鉛染(5 min)1次，能明顯提高樣本反差(見圖1、2)。

圖1 傳統(tǒng)方法染色，線粒體結(jié)構(gòu)顯示模糊

圖2 改良方法染色，線粒體結(jié)構(gòu)明顯清晰

在重金屬鹽染色過程中，容易出現(xiàn)染色效果欠佳，分析其原因及克服方法：①標(biāo)本本身前固定處理不好，標(biāo)本體積過大，取材時間過長，取材環(huán)境溫度過高等。 因此標(biāo)本體積盡可能地小(1 mm×1 mm×1 mm)，快速取材，降低取材環(huán)境溫度；②后固定時鋨酸沒有完全滲透固定，主要是標(biāo)本體積過大所致，在不影響研究結(jié)果的前提下越小越好[5]；③染液pH的影響，一般醋酸鈾pH值為4.5，檸檬酸鉛pH為12，效果較好；④水洗工具的改進(jìn)。傳統(tǒng)的水洗是用燒杯裝有雙蒸水水洗，本實驗室為避免鉛污染，用封口膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的燒杯水洗，水洗時間30 min。本實驗室采用注射器，把注射器的尖頭磨平后用細(xì)流水反復(fù)沖洗銅網(wǎng)的正反面約2 min，大大縮短了水洗時間，且操作簡單，沒有污染;⑤樣品結(jié)構(gòu)反差強弱，與染液溫度有關(guān)，當(dāng)染液從4 ℃冰箱中取出后，不要立刻進(jìn)行染色，而應(yīng)將染液在室溫中放置一段時間，使染液溫度達(dá)到室溫，否則即使增加染色時間，也不能獲得良好反差。

2 重金屬投影噴鍍

本實驗室采用掃描電鏡的噴鍍技術(shù)[6]，具體方法是在樣本鈾染和鉛染后，在生物樣品表面再噴涂一層碳離子，能明顯提高圖像反差，組織微細(xì)結(jié)構(gòu)分辨率明顯提高。解決了高分辨率和增加反差之間的矛盾。

3 碳膜代替方華膜撈片

一般撈片都用方華膜[7]或者裸網(wǎng)撈片。方華膜在電子束的照射下容易產(chǎn)生漂移，甚至使膜破碎，損壞被觀察樣品。本實驗室采用碳膜撈片。與其他制膜材料比較，碳的密度較高，散射能力較強，碳膜的機械強度、親水性及其熱穩(wěn)定性都優(yōu)于其他種類的支持膜，進(jìn)而可減少樣品的熱漂移，增加樣品的穩(wěn)定性[8-9]。碳膜在高分辨率觀察時使用，其厚度在2～10 nm，其缺點是易碎，制好的碳膜不易長久保存。

4 樣品切片厚度對圖像反差的影響

生物超薄切片厚度為50～100 nm，切片越薄越利于電子束的透過，且散射電子少，成像的亮度大，色差小，分辨率高[10-11]。但過薄的切片，由于其質(zhì)量厚度太小，成像的反差反而較弱，不利于觀察。所以，通常在保證一定分辨率的前提下，選擇適當(dāng)?shù)那衅穸?75 nm)，可以增加圖像的反差。

5 選擇小孔徑光闌

物鏡光闌孔徑越小，圖像反差越大[12]。但反差的提高并不與光闌的大小成正比，當(dāng)光闌過小時，會造成圖像亮度過暗，容易產(chǎn)生污染或散射。所以在物鏡光闌的選擇時，應(yīng)兼顧其他的成像因素[13-14]。

6 降低加速電壓

電子散射角度的大小與加速電壓的平方成反比，降低電子加速電壓可以提高圖像的反差[15]。但加速電壓降低時，低速電子波易受雜散電磁場干擾，同時電子的穿透力低，色差增大，最終會造成分辨率的降低。

7 正確的欠焦

在電鏡觀察樣品時，樣品質(zhì)量厚度迅速改變區(qū)域所對應(yīng)的圖像上會出現(xiàn)費涅爾衍射環(huán)。當(dāng)物鏡過焦時，費涅爾條紋成暗線，欠焦時則呈現(xiàn)亮線;在正焦時，費涅爾條紋消失【4】。樣品要求電鏡高倍率觀察時，利用費涅爾衍射環(huán)來增加圖像反差，選擇適當(dāng)?shù)那方沽?，可獲得最好的圖像反差，但欠焦量不宜過大。通常不能用過焦的方式來提高反差。

8 結(jié) 語

影響生物電鏡圖像反差的因素很多，圖像的反差除與樣品本身密度和厚度有關(guān)，還與電子顯微鏡的工

作條件有關(guān)，只有注意到以上每個實驗操作環(huán)節(jié)，才能得到較滿意的圖像反差效果。

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