毒死蜱和百菌清對斑馬魚早期發(fā)育階段的聯(lián)合毒性效應(yīng)

李 健，楊桂玲，趙慧宇，王 強，朱朝華

(1.海南大學 熱帶農(nóng)林學院，海南 ?？?570228； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與標準研究所，浙江 杭州 310021)

毒死蜱自1965年投入美國市場，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭害蟲防治[1]。在農(nóng)作物病蟲害防治過程中，毒死蜱會進入農(nóng)田土壤，并且通過滲透、排水等方式轉(zhuǎn)移至地下水或河流，造成水體污染[2]。有研究報道，在相對集中的玉米種植區(qū)，河水中的毒死蜱濃度可達0.1 μg·L-1[3]，大豆種植區(qū)地表水毒死蜱濃度最高達10.8 μg·L-1[4]。在美國和墨西哥的海洋沉積物、河流、湖泊、地下水、城市污水系統(tǒng)，甚至在雨水和空氣中均能檢測到毒死蜱殘留[5-6]。在土耳其地中海沿岸，毒死蜱已成為環(huán)境中農(nóng)藥殘留檢出頻率較高的品種[7]。由于毒死蜱在水中降解的速度緩慢，因此，其在水中的殘留會對水生生物及其他生物造成潛在危害。趙穎等[8]研究表明，毒死蜱對黑魚的96 h-LC50(半致死濃度)為0.101 mg·L-1，對斑馬魚成魚的96 h-LC50為0.291 mg·L-1。徐吉洋等[9]研究表明，毒死蜱對大型溞的48 h-LC50為0.6 μg·L-1，對介形蟲的48 h-LC50為2.86 μg·L-1。Furst等[10]通過內(nèi)分泌干擾物篩選細胞培養(yǎng)實驗證明毒死蜱具有雌激素作用，但目前還未見關(guān)于毒死蜱對斑馬魚幼魚內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的報道。

百菌清是由美國鉆石堿公司于1963年開發(fā)出來的一種取代苯類殺菌劑，廣泛用于蔬菜、水果、水稻等作物上的多種真菌病害防治[11]。由于其使用廣泛，關(guān)于百菌清在土壤、水、沉積物等環(huán)境介質(zhì)中的殘留污染已有較多報道[12-13]。Sakkas等[14]研究表明，在英國沿海及地中海地區(qū)的碼頭、港灣等水體中，有相當濃度的百菌清殘留，濃度在0.008～1.38 g·L-1。Caux等[15]研究表明，在加拿大的地表水和地下水中檢測到百菌清殘留，它在水中的半衰期小于2 h，但在30 d后還能檢出，持留期較長。環(huán)境中大量殘留的百菌清可能會對水生生物的生長、發(fā)育，以及群落結(jié)構(gòu)等造成不利影響。有報道表明，百菌清對鯉魚的48 h-LC50為110 μg·kg-1，對鯰魚的48 h-LC50為386 μg·kg-1，對虹魚的48 h-LC50為250 μg·kg-1。方琪等[16]報道，百菌清可以促進雄激素敏感細胞增殖；Zhang等[17]研究表明，百菌清對雌激素受體基因(ERα)有影響。但目前還未見關(guān)于百菌清對斑馬魚幼魚內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的報道。

隨著不同種類農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥復合污染問題受到越來越多的關(guān)注。尚艷芬等[18]對大量蔬菜樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，毒死蜱和百菌清兩種農(nóng)藥常同時檢出，且超標率較高。汪志威等[19]報道，在設(shè)施作物番茄和黃瓜上，毒死蜱和百菌清作為常用農(nóng)藥被大量使用。因此，毒死蜱和百菌清的毒性和內(nèi)分泌干擾研究，對生態(tài)風險評估具有重要意義。本文以斑馬魚為模式生物，運用靜態(tài)法和實時熒光定量PCR方法，研究毒死蜱和百菌清，及其二元組合對斑馬魚胚胎的急性毒性，和對斑馬魚幼魚性腺軸相關(guān)基因的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

95%毒死蜱原藥，購自連云港市東金化工有限公司；98.2%百菌清原藥，購自江陰蘇利化學有限公司。RNA提取試劑盒(TakaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、去基因組DNA試劑盒(gDNA Eraser)和實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)，均購自大連Takara公司。

StepOnePlusTM Real-Time PCR儀，美國Applied Biosystems公司；智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；Thermo Fresco 17臺式離心機，德國Thermo Fisher公司。

實驗用魚為斑馬魚(Brachydaniorerio)野生型品系(AB型)，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)監(jiān)測中心提供。斑馬魚在恒定溫度(27±1℃)、14 h∶10 h光/暗條件的循環(huán)水系統(tǒng)中培養(yǎng)。每天喂養(yǎng)2次新鮮孵化的豐年蝦。實驗前一天晚上，將雄性和雌性斑馬魚以2∶1的比例配對放入產(chǎn)卵缸，第二天早上開燈給予光照刺激，使其交配產(chǎn)卵。收集魚卵，用系統(tǒng)水清洗，并在顯微鏡下觀察。選取正常發(fā)育的胚胎，用于后續(xù)的暴露實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚胚胎急性毒性實驗

急性毒性實驗參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)的標準[20]。采用靜態(tài)法，設(shè)置8個濃度和1個空白對照組，空白組和實驗組DMSO含量均為0.001%(體積分數(shù))，具體濃度設(shè)置見表1。以24孔板作為染毒容器，每孔放置1枚胚胎，每個濃度設(shè)置3個重復。將空白對照組和實驗組分別置于(26±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，光暗周期為14 h∶10 h。斑馬魚死亡判斷依據(jù)：卵是否出現(xiàn)白色凝結(jié)，小魚有無心率，血液是否流動。在此期間，每24 h觀察斑馬魚胚胎的死亡情況并記錄。

1.2.2 斑馬魚胚胎急性聯(lián)合毒性實驗

以毒死蜱和百菌清單劑對斑馬魚胚胎的96h-LC50為各自的毒性單位。采用等毒性配比，設(shè)置8個濃度和1個空白對照，每個濃度設(shè)置3個重復，每24 h觀察斑馬魚胚胎的死亡情況，具體濃度設(shè)置見表1。

1.2.3 斑馬魚胚胎短期暴露及基因測定

根據(jù)毒死蜱和百菌清單劑的LC50，設(shè)置高、中、低3個濃度和1個空白對照，每個濃度設(shè)置3個重復，每個濃度隨機挑選100枚正常發(fā)育的胚胎放入500 mL燒杯中。毒死蜱濃度設(shè)置為6.7、26.7、106.7 μg·L-1，百菌清濃度設(shè)置為1.1、4.4、17.6 μg·L-1，毒死蜱+百菌清聯(lián)合暴露濃度設(shè)置為6.7 μg·L-1+1.1 μg·L-1、26.7 μg·L-1+4.4 μg·L-1、106.7 μg·L-1+17.6 μg·L-1。將實驗組和對照組放入(26±1)℃培養(yǎng)箱中暴露96 h，光暗周期為14 h∶10 h，每24 h更換一次藥劑。實驗結(jié)束后，每個濃度隨機挑選15條斑馬魚用于基因測定。

按照試劑盒說明書提取總RNA。用紫外分光光度法測定RNA的濃度和純化質(zhì)量。按照試劑說明書對RNA進行反轉(zhuǎn)錄。按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書在冰上配制20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸20 s。所用基因引物序列參考常菊花[21]的報道(表2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)在SPSS 7.5平臺上進行整理與分析，利用Origin 8.0軟件制圖。

聯(lián)合毒性參照相加指數(shù)(additional index，AI)法[22]進行評定。AI>0時為協(xié)同作用，AI<0時為拮抗作用，AI=0時為相加作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗結(jié)果

如表3所示：毒死蜱對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為2.139 mg·L-1，據(jù)現(xiàn)行標準[23]屬于中等毒性(1～10 mg·L-1)，95%置信區(qū)間為0.921～16.327 mg·L-1；百菌清對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.353 mg·L-1，屬于高毒性(0.1～1.0 mg·L-1)，95%置信區(qū)間為0.247～0.402 mg·L-1。在整個實驗周期內(nèi)，對照組未見死亡。

表1 毒死蜱和百菌清急性毒性實驗濃度設(shè)置Table 1 Concentration of chlorpyrifos and chlorothalonil in acute toxicity experiment

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for quantification of mRNA expression by real-time PCR

表3 毒死蜱和百菌清對斑馬魚的急性毒性Table 3 Acute toxicity of chlorpyrifos and chlorothalonil to zebrafish

2.2 聯(lián)合毒性實驗結(jié)果

如表4所示：毒死蜱對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.380 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.141～1.605 mg·L-1；百菌清對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.063 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.058～1.643 mg·L-1。采用相加指數(shù)法計算聯(lián)合效應(yīng)，AI值為1.82，表現(xiàn)出協(xié)同作用(AI>0)。在整個實驗周期內(nèi)，對照組未見死亡。

2.3 對斑馬魚幼魚性腺軸相關(guān)基因表達的影響

如圖1所示：低濃度(6.7 μg·L-1)毒死蜱下，斑馬魚體內(nèi)的ERβ2基因的表達量顯著(P<0.05)下調(diào)，為對照組的70%，其余基因未見明顯變化；中濃度(26.7 μg·L-1)毒死蜱下，斑馬魚體內(nèi)的VTG2、VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因的表達量顯著(P<0.05)上調(diào)，分別為對照組的2.5、16.5、8.3、14.8、5.0倍；高濃度(106.7 μg·L-1)毒死蜱下，斑馬魚體內(nèi)的VTG2、ERβ2和ERβ1基因的表達量顯著(P<0.05)上調(diào)，分別為對照組的2.4、3.0、2.5倍，其余基因未見明顯變化。

如圖2所示：低濃度(1.1 μg·L-1)百菌清下，斑馬魚體內(nèi)的VTG1、VTG2、ERβ1和ERβ2基因的表達量顯著(P<0.05)上調(diào)，分別為對照組的3.9、5.4、2.6、3.0倍，其余基因未見明顯變化；中濃度(4.4 μg·L-1)百菌清下，斑馬魚體內(nèi)的ERβ1基因的表達量顯著(P<0.05)下調(diào)，為對照組的76%，其余基因未見明顯變化；高濃度(17.6 μg·L-1)百菌清下，斑馬魚體內(nèi)的ERβ1基因的表達量極顯著(P<0.01)上調(diào)，為對照組的1.6倍，其余基因未見明顯變化。

如圖3所示：暴露于低劑量組(6.7 μg·L-1毒死蜱+1.1 μg·L-1百菌清)，斑馬魚體內(nèi)的VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因的表達量顯著(P<0.05)下調(diào)，分別為對照組的22%、44%、45%、46%，其余基因未見明顯變化；暴露于中劑量組(26.7 μg·L-1毒死蜱+4.4 μg·L-1百菌清)，斑馬魚體內(nèi)的VTG1基因的表達量顯著(P<0.05)下調(diào)，為對照組的54%，其余基因未見明顯變化；暴露于高劑量組(106.7 μg·L-1毒死蜱+17.6 μg·L-1百菌清)，斑馬魚體內(nèi)的VTG2基因的表達量極顯著(P<0.01)上調(diào)，為對照組的2.5倍，其余基因未見明顯變化。

表4 毒死蜱和百菌清對斑馬魚聯(lián)合染毒結(jié)果Table 4 Combined poisoning of chlorpyrifos and chlorothalonil to zebrafish

標“*”或“**”的表示與CK相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。下同。* or ** indicated significance between the treatment and CK at P<0.05 or P<0.01，respectively. The same as below.圖1 不同濃度的毒死蜱對斑馬魚幼魚性腺軸相關(guān)基因表達量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of chlorpyrifos on gene expression of gonad of zebrafish larvae

圖2 不同濃度的百菌清對斑馬魚幼魚性腺軸相關(guān)基因表達量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chlorothalonil on gene expression of gonad of zebrafish larvae

圖3 不同濃度的毒死蜱+百菌清二元組合對斑馬魚幼魚性腺軸相關(guān)基因表達量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of chlorpyrifos+chlorothalonil on gene expression of gonad of zebrafish larvae

3 討論

3.1 毒死蜱、百菌清二元聯(lián)合暴露急性毒性增強

本研究發(fā)現(xiàn)，毒死蜱單劑對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為2.139 mg·L-1，表現(xiàn)為中毒。趙穎等[8]研究表明，毒死蜱對斑馬魚成魚的96 h-LC50為0.291 mg·L-1。本研究中，百菌清單劑對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.353 mg·L-1，表現(xiàn)為高毒。周軍英等[24]研究表明，百菌清對斑馬魚成魚的48 h-LC50為0.009 mg·L-1。對比可知，斑馬魚成魚較胚胎對毒死蜱和百菌清更為敏感，可能的原因是胚胎期卵膜起到了保護作用，卵膜阻止了外來大分子的穿透進入。楊亞洲等[25]的研究同樣表明，毒死蜱對稀有鮈鯽胚胎和成魚的96 h-LC50值分別為7.59 mg·L-1和0.027 2 mg·L-1，成魚較胚胎對毒死蜱更敏感。

毒死蜱+百菌清聯(lián)合暴露時，毒死蜱的96 h-LC50值為0.38 mg·L-1，百菌清的96 h-LC50值為0.063 mg·L-1，分別為單獨暴露時的5.63和5.60倍。相加指數(shù)法計算結(jié)果顯示，毒死蜱和百菌清聯(lián)合暴露對斑馬魚胚胎表現(xiàn)為協(xié)同作用?？赡艿脑蚴牵寒攦煞N類型的農(nóng)藥在斑馬魚體內(nèi)同時存在時，有機磷酸酯類農(nóng)藥首先會與p450酶系結(jié)合，導致分子活化，然后阻止p450酶系與百菌清結(jié)合和降解[26-27]。

3.2 毒死蜱對斑馬魚幼魚具有雌激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)

性激素對斑馬魚的第二性征和生長發(fā)育具有重要作用，性激素水平及平衡的改變可能影響生殖過程和后代的生殖能力。CYP19α屬于細胞色素p450家族，它催化斑馬魚體內(nèi)雄激素(如睪酮和雄烯二酮)轉(zhuǎn)化為雌激素，是斑馬魚體內(nèi)雌激素生物合成中的限速酶[28]。斑馬魚體內(nèi)雌激素受體存在ERα和ERβ兩種類型，其中雌激素受體ERβ存在異型體，分別為ERβ1和ERβ2。雌激素與受體(ERα、ERβ1和ERβ2)結(jié)合發(fā)揮作用。卵黃蛋白原(VTG)是一種環(huán)境雌激素暴露的生物標志物，為魚類胚胎和幼體早期階段發(fā)育提供營養(yǎng)來源[29]。

人乳腺癌細胞(MCF-7)是內(nèi)分泌干擾物體外篩選實驗的常用細胞。Furst等[10]的研究表明，毒死蜱對乳腺癌成纖維細胞(MCF-7BUS)的增殖和ER反式(轉(zhuǎn))的激活有影響，且其作用是E2(17-β雌二醇) 最大作用的25%～36%，表明毒死蜱對MCF-7BUS細胞存在雌激素作用。Grünfeld等[30]驗證了毒死蜱對MCF-7BUS 細胞ERα和ERβ穩(wěn)態(tài)水平的影響，發(fā)現(xiàn)使用毒死蜱可輕微刺激并提高ERβmRNA水平(P=0.006)。在本研究中：低濃度毒死蜱下，斑馬魚體內(nèi)的ERβ2基因表達與對照組相比顯著下調(diào)；中濃度毒死蜱下，斑馬魚體內(nèi)的VTG2、VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因表達與對照組相比顯著上調(diào)；高濃度毒死蜱下，斑馬魚體內(nèi)的VTG2、ERβ2和ERβ1基因表達與對照組相比顯著上調(diào)。表明毒死蜱對斑馬魚幼魚具有雌激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，與前人研究結(jié)果一致。

3.3 百菌清對斑馬魚幼魚具有雌激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)

本研究中：低濃度百菌清下，斑馬魚體內(nèi)的VTG1、VTG2、ERβ1和ERβ2基因表達與對照組相比顯著上調(diào)；中濃度百菌清下，斑馬魚體內(nèi)的ERβ1基因表達與對照組相比顯著下調(diào)；高濃度百菌清下，斑馬魚體內(nèi)的ERβ1基因表達與對照組相比顯著上調(diào)。低濃度的百菌清對斑馬魚幼魚性腺軸基因的促進作用最為明顯，說明百菌清對斑馬魚幼魚具有雌激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。這與Zhang等[17]運用體外雙熒光素酶報告基因測試方法，證明百菌清對ERα基因有親和力，且百菌清具有潛在的雌激素干擾效應(yīng)的結(jié)論一致。

3.4 毒死蜱+百菌清聯(lián)合暴露與單獨暴露相比，對斑馬魚幼魚的雌激素干擾效應(yīng)降低

聯(lián)合暴露條件下，低劑量組斑馬魚體內(nèi)的VTG1、ERβ1、ERβ2基因表達與對照組相比顯著下調(diào)，中劑量組斑馬魚體內(nèi)VTG1基因與對照組相對比顯著下調(diào)，高劑量組VTG2基因相比照組顯著上調(diào)。這說明，二元聯(lián)合暴露與單獨暴露相比，對斑馬魚雌激素內(nèi)分泌的干擾效應(yīng)降低。傳統(tǒng)毒理學認為，毒物到一定劑量時所引發(fā)的效應(yīng)，高劑量會大于低劑量，這種線性的劑量-效應(yīng)關(guān)系是進行生態(tài)風險評價的標準。然而對于內(nèi)分泌干擾物而言，其暴露于低劑量(即其在接近甚至低于無可見有害作用水平或?qū)?yīng)的安全劑量)時可引起生物學效應(yīng)，存在非單調(diào)劑量-效應(yīng)關(guān)系，其曲線呈現(xiàn)U型或倒U型等，從而使暴露于低劑量EDCs所產(chǎn)生的生物學效應(yīng)可能大于等于高劑量所產(chǎn)生的效應(yīng)[31]。從實驗結(jié)果來看，毒死蜱基因表達-劑量效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為倒U型，百菌清基因表達-劑量效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為U型，所以，聯(lián)合暴露時，毒死蜱的倒U型與百菌清的U型可能形成互補關(guān)系，造成對斑馬魚幼魚的雌激素干擾效應(yīng)降低，但具體的干擾機制仍須作進一步研究。

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