長期施肥對水田和旱地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、活性碳氮及酶活性的影響

王桂躍，蘇 婷，韓海亮，譚禾平，包 斐，趙福成

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 東陽玉米研究所，浙江 東陽 322100)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與土壤中幾乎一切生物化學(xué)反應(yīng)，對維持土壤生態(tài)平衡具有重要作用[1]。微生物群落對環(huán)境條件的變化反應(yīng)敏捷，因而常被作為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估的敏感性生物指標(biāo)之一[2]。土壤微生物生物量既是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力，又可作為土壤中植物有效養(yǎng)分的儲備庫，對土壤環(huán)境因子的變化極為敏感，土壤的微小變動均會引起其活性變化[3]。土壤微生物生物量的主要組成包括微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)和微生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)。溶解性有機(jī)碳(dissolved organic carbon，DOC)和溶解性有機(jī)氮(dissolved organic nitrogen，DON)是土壤溶解性有機(jī)質(zhì)的2個(gè)重要組成部分。MBC、MBN、DOC和DON是對土壤質(zhì)量變化響應(yīng)最明顯和最迅速的土壤活性組成部分[4]。土壤酶是土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要參與者，是土壤有機(jī)體的代謝動力，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[5]。因此，土壤微生物群落、活性碳氮含量，以及土壤酶活性常被用來評價(jià)土壤的生物學(xué)性狀。

施肥是影響土壤質(zhì)量演化及其可持續(xù)利用最為深刻的農(nóng)業(yè)措施之一[3]，它通過改變土壤微生物活性、數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，從而改變土壤C、N養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率和途徑，影響土壤供氮能力和碳儲備能力，進(jìn)而影響土壤質(zhì)量。有關(guān)施肥對土壤物理、化學(xué)性質(zhì)及環(huán)境的影響，已有大量研究[6]，但涉及土壤生物學(xué)特性的研究較少。近20年來，土壤生物學(xué)特性在土壤肥力研究中的地位顯著加強(qiáng)。前人研究認(rèn)為，施用有機(jī)肥料可以顯著提高土壤微生物量碳、氮的含量，以及土壤酶活性，并且隨著用量的增大，效果也隨之增強(qiáng)[7-8]。另有研究表明，施用化學(xué)肥料也能提高土壤微生物量碳的含量[9]。但是，王繼紅等[10]研究表明，過量施用化肥會使土壤微生物量碳的含量降低，而適量施用氮肥或磷肥均能夠使土壤中微生物生物量碳、氮含量增加[11]。路磊等[12]研究也表明，單施化肥使土壤中的微生物生物量氮的含量降低，王俊華等[13]和卜洪震等[14]長期施肥研究結(jié)果表明，與單施化肥相比，有機(jī)肥與化肥配合施用條件下土壤中微生物生物量碳的含量提高更顯著。然而，迄今在該領(lǐng)域的研究大多集中在單一施用化肥或有機(jī)肥對少數(shù)土壤微生物學(xué)指標(biāo)的影響上，關(guān)于長期測土配方施肥下土壤微生物群落、微生物量，以及土壤酶活性等多種土壤生物學(xué)指標(biāo)的變化，尚缺少相關(guān)研究。

本研究在浙江省東陽玉米研究所定位監(jiān)測基地通過6 a的測土配方試驗(yàn)，旨在了解長期施肥對水田和旱地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、活性碳氮含量及酶活性的影響，以期為科學(xué)施肥、保護(hù)和合理利用現(xiàn)有耕地資源提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

定位試驗(yàn)于2009年開始，在浙江省東陽玉米研究所基地內(nèi)進(jìn)行，土壤為黃紅壤，0～20 cm土層土壤基本理化性狀：有機(jī)質(zhì)13.8 g·kg-1，全氮 0.50 g·kg-1，全磷0.42 g·kg-1，全鉀1.54 g·kg-1，速效氮 21.6 mg·kg-1，有效磷 3.25 mg·kg-1，速效鉀 20.3 mg·kg-1，pH值5.42。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理：①PCK，水田無肥區(qū)，不施用任何肥料；②PCF，水田常規(guī)施肥區(qū)，按當(dāng)?shù)刂饕┓柿?N，210 kg·hm-2；P2O5，60 kg·hm-2；K2O，70 kg·hm-2)及化學(xué)肥料品種(尿素、過磷酸鈣、氯化鉀)施肥；③PSTF，水田測土配方施肥純化肥區(qū)，根據(jù)土壤養(yǎng)分情況和作物確定最佳施肥量(N，225 kg·hm-2；P2O5，85 kg·hm-2；K2O，120 kg·hm-2)，肥料品種同PCF；④PSTF+OF，水田測土配方施肥化肥+有機(jī)肥區(qū)，在PSTF的基礎(chǔ)上增施商品精致有機(jī)肥(有機(jī)質(zhì)含量45%，N 1.8%+P2O51.6%+K2O 2.2%)22 500 kg·hm-2；⑤DCF，旱地常規(guī)施肥區(qū)，N、P2O5、K2O投入量分別為275、60、175 kg·hm-2，肥料分別選用尿素、鈣鎂磷肥和氯化鉀；⑥D(zhuǎn)STF+OF，旱地測土配方施肥化肥+有機(jī)肥區(qū)，N、P2O5、K2O投入量分別為240、72、140 kg·hm-2，肥料品種同DCF，此外再施用商品精致有機(jī)肥(有機(jī)質(zhì)含量45%，N 1.8%+P2O51.6%+K2O 2.2%)22 500 kg·hm-2。各處理除施肥不同外，其他土壤與作物管理措施均保持一致。

各處理小區(qū)面積33.3 m2，水田小區(qū)間用水泥板隔開，防止肥、水互相滲透。水泥板高60 cm、厚5 cm，埋深30 cm，露出田面30 cm。每小區(qū)各有一進(jìn)水口和一出水口，進(jìn)水口位置高于出水口，安裝閥門。旱地小區(qū)以排水溝和水泥板相隔，水泥板厚度5 cm，埋深40 cm，高出畦面20 cm。水田種植一年一季晚稻甬優(yōu)9號，旱地常年種植春夏兩季玉米，品種均為渝糯7號。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集于2015年3月底。每小區(qū)按S形取樣法5點(diǎn)取樣，取0～20 cm層土壤，均勻混合。土樣帶回室內(nèi)揀去石礫和植物殘?bào)w等，過2 mm土篩，分成3份：一份風(fēng)干后，用于測定土壤理化性狀和土壤酶活性；第二份立即保存于4 ℃冰箱中，用于土壤微生物量碳、氮的測定；第三份土樣保存于-70 ℃冰箱，用于土壤磷脂脂肪酸(PLFA)的測定。

1.3 樣品分析方法

土壤化學(xué)性質(zhì)測定參照文獻(xiàn)[15]：土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化法；土壤全氮采用半微量開氏法；全碳采用重鉻酸鉀容量法；土壤有效磷采用碳酸氫鈉(Olsen)法；土壤速效鉀采用乙酸銨提取火焰分光光度法；土壤pH采用1∶2.5土水質(zhì)量體積比浸提，用pH計(jì)測定。

土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌種群數(shù)量的測定分別采用牛肉膏蛋白胨、孟加拉紅和改良高氏一號培養(yǎng)基平板稀釋法[16]，平板計(jì)數(shù)；PLFA的提取與純化參考Eli等[17]和吳愉萍[18]的方法進(jìn)行，不同磷脂脂肪酸的種類和含量表示不同微生物的種類和生物量，以12∶0、14∶0、15∶0、16∶0、17∶0、18∶0、20∶0、i15∶0、i17∶0、a15∶0、a17∶0、cy17∶0、cy19∶0表示細(xì)菌生物量[14-16]，以18∶2ω6、18∶3ω6、18∶1ω9表示真菌生物量[19-22]，以16∶0 10Me、17∶0 10Me、18∶0 10Me表示放線菌生物量[23]；土壤MBC、MBN采用氯仿熏蒸浸提方法測定(轉(zhuǎn)換系數(shù)分別取0.38和0.54)[24]；使用流動注射分析儀測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量；DOC、DON含量采用KCl溶液浸提，然后使用Multi N/C 3100測定DOC、溶解性總氮(TDN)含量，TDN減去銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的剩余部分即為DON含量；土壤纖維素酶、脲酶、脫氫酶和過氧化氫酶分別采用3，5-二硝基水楊酸法、靛酚藍(lán)比色法、TTC還原法和高錳酸鉀滴定法測定[25]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，利用SPSS 21.0 for Windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用ANOVA進(jìn)行方差分析、LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對土壤化學(xué)性狀的影響

從表1可以看出，與長期不施肥(PCK)相比，水田施肥可顯著(P<0.05)提高土壤有效磷和速效鉀的含量，同時(shí)能顯著(P<0.05)降低土壤pH值，但在試驗(yàn)期間對土壤有機(jī)質(zhì)、全碳和全氮含量無顯著影響。水田中，與常規(guī)施肥(PCF)相比，PSTF處理的土壤化學(xué)性狀無顯著差異，而PSTF+OF處理的土壤全碳和有效磷含量顯著(P<0.05)增加。與水田相比，在相同母質(zhì)的旱地上，DSTF+OF處理的旱地土壤有機(jī)質(zhì)、全碳、全氮、有效磷和速效鉀含量比水田相應(yīng)處理(PSTF+OF)下分別增加31.18%、16.32%、83.64%、9.76%和2.23%，pH值下降15.15%。

2.2 對土壤可培養(yǎng)微生物的影響

由圖1可知，整體上各處理的可培養(yǎng)微生物數(shù)量差異不大，僅DSTF+OF處理的真菌含量顯著(P<0.05)高于其他處理。

2.3 對土壤微生物量的影響

由圖2可知，不同施肥處理對土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著(P<0.05)影響，但對放線菌無顯著影響。水田中，與長期不施肥(PCK)相比，PSTF+OF處理顯著(P<0.05)提高了土壤細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量，但對真菌無顯著影響。與水田上的DSTF+OF處理相比，旱地上相應(yīng)的DSTF+OF處理下細(xì)菌和真菌的磷脂脂肪酸含量均顯著(P<0.05)增加。

表1 長期施肥各處理對土壤化學(xué)性狀的影響Table 1 Effects of long-term fertilization systems on soil chemical properties

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Data followed by no same letters within the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

同一類微生物上各處理間無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Treatments marked by no same letters indicated significant difference at P<0.05 within the same microbe group. The same as below.圖1 長期施肥各處理對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響Fig.1 Effects of long-term fertilization systems on culturable microorganisms

圖2 長期施肥各處理對土壤微生物PLFA含量的影響Fig.2 Effects of long-term fertilization systems on PLFAs

2.4 對土壤活性碳氮的影響

從表2可以看出，水田中，相較PCF，PCK處理的土壤活性碳氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量差異不顯著，但PSTF處理顯著(P<0.05)提高了土壤微生物量碳的含量，PSTF+OF處理能同時(shí)顯著(P<0.05)增加土壤微生物碳、氮的含量。旱地中，與旱地常規(guī)施肥處理(DCF)相比，DSTF+OF處理能顯著(P<0.05)提高土壤微生物量碳、微生物量氮和硝態(tài)氮的含量，但可溶性有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮和銨態(tài)氮含量均無顯著差異。

2.5 對土壤酶活性的影響

由表3可知，各處理對纖維素酶活性均無顯著影響。水田中各處理間脲酶活性無顯著差異，與之相比，旱地處理(DCF與DSTF+OF)的脲酶活性顯著(P<0.05)提高。與不施肥處理(PCK)相比，水田中PCF處理的脫氫酶活性無顯著變化，但其他處理的脫氫酶活性均顯著(P<0.05)升高。與不施肥或不施有機(jī)肥的處理相比，無論是在水田還是旱地中施入有機(jī)肥的處理(PSTF+OF和DSTF+OF)的過氧化氫酶活性均顯著(P<0.05)升高。

2.6 各因素的相關(guān)性分析

相關(guān)分析顯示(表4)，微生物群落間，細(xì)菌和真菌含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，而放線菌與細(xì)菌含量呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)；土壤活性碳、氮因素間，微生物量氮與可溶性有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮、硝態(tài)氮存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)相關(guān)性，硝態(tài)氮與可溶性有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮分別呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關(guān)，銨態(tài)氮與可溶性有機(jī)碳呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)；各土壤酶活性間無顯著相關(guān)性。此外，硝態(tài)氮與微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.05)相關(guān)性，微生物量碳與土壤脫氫酶和過氧化氫酶呈顯著(P<0.05)正相關(guān)。

表2 長期施肥各處理對土壤活性碳氮含量的影響Table 2 Effects of long-term fertilization systems on labile organic carbon and nitrogen mg·kg-1

表3 長期施肥各處理對土壤酶活性的影響Table 3 Effects of long-term fertilization systems on enzyme activities

表4 土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)、活性碳氮和土壤酶活性的相關(guān)分析Table 4 Correlation coefficients within microbial community structure，labile organic carbon and nitrogen and enzyme activities

*，P<0.05; **，P<0.01.

3 討論

3.1 長期施肥對土壤化學(xué)性狀的影響

長期施用有機(jī)肥或有機(jī)肥與N、P、K配合施用可提高土壤有機(jī)質(zhì)和氮磷鉀養(yǎng)分含量，改善土壤物理性狀，調(diào)節(jié)土壤C/N，促進(jìn)作物和土壤微生物的生長[23]。土壤有機(jī)碳含量變化主要受到施肥的影響，同時(shí)也受到環(huán)境因素，尤其是土壤水分、氣候變化、大氣沉降等的影響[13]，本研究中僅考慮了N、P、K和有機(jī)肥對土壤化學(xué)性狀的影響。在水田中，與PSTF處理相比，PSTF+OF處理的土壤有效磷含量顯著增加，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)肥的施用更有利于土壤理化特性的改善和養(yǎng)分的持續(xù)供應(yīng)，促進(jìn)土壤大團(tuán)聚體內(nèi)微團(tuán)聚體的形成，而僅施用化肥氮磷鉀對土壤大團(tuán)聚體內(nèi)微團(tuán)聚體形成的促進(jìn)作用緩慢，且易致土壤板結(jié)。與水田相比，在相同母質(zhì)的旱地上，施肥處理提高土壤養(yǎng)分的效應(yīng)更明顯，可能與旱地化肥用量比水田高有關(guān)。

3.2 長期施肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物易受土壤營養(yǎng)狀況、pH值、質(zhì)地、溫度、水分和通氣性等條件的影響，因此，土壤的利用方式和管理措施會使土壤微生物發(fā)生變化[26]。由于土壤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，關(guān)于施肥究竟如何影響土壤微生物的變化問題尚缺乏共識[27]。本研究中，不同施肥條件下，水田與旱地兩種利用方式土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量差異不大，僅DSTF+OF處理的真菌含量顯著高于其他處理，這可能與培養(yǎng)方法有關(guān)。前人研究表明，運(yùn)用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基方法鑒定的微生物僅占環(huán)境總微生物的0.1%～10%，這不能完全反映土壤中微生物真實(shí)的分布情況[28]。Bardgett等[29]認(rèn)為，土壤中磷脂脂肪酸的組成可以表示土壤微生物群落的生物量和結(jié)構(gòu)，一些研究發(fā)現(xiàn)，直接從土壤中提取的磷脂脂肪酸含量可以準(zhǔn)確地反映出土壤微生物的生物量[29-32]。本研究測定了不同施肥處理下的土壤微生物PLFA含量，結(jié)果顯示，在水田中PCK、PCF與PSTF之間細(xì)菌PLFA含量的差異不顯著，只有PSTF+OF細(xì)菌PLFA含量顯著高于PCK；而旱地的DSTF+OF處理下細(xì)菌PLFA含量顯著高于水田各處理。陳曉娟等[33]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和真菌PLFA水稻田高于旱地，而本研究結(jié)果恰好相反，而放線菌PLFA兩者無顯著差異。以上結(jié)果的不一致可能一方面是因?yàn)楹档氐氖┓柿勘人锔撸硪环矫嬉才c取樣時(shí)間有關(guān)，本試驗(yàn)在初春取樣，經(jīng)過較長時(shí)間的冬期后，兩類土壤的溫度、水分和通氣性均趨于相近。Schloter等[34]研究顯示，精準(zhǔn)施肥與傳統(tǒng)施肥相比，對表層土壤的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)并無明顯影響，本研究亦得到類似的結(jié)果，即水田測土配方施肥(PSTF)和常規(guī)施肥處理間細(xì)菌、真菌、放線菌含量均無顯著差異。

3.3 長期施肥對土壤活性碳氮的影響

土壤微生物量碳能反映土壤有效養(yǎng)分狀況和生物活性[35]，微生物量氮是土壤氮素的一個(gè)重要儲備庫，了解土壤微生物量氮的消長有助于揭示進(jìn)入土壤肥料氮素的生物固定和釋放的本質(zhì)[36-37]。對于農(nóng)田土壤，不同施肥管理對土壤微生物生物量有明顯的影響，與不施肥處理土壤相比，施肥可顯著提高土壤的微生物量碳氮的含量，其中化肥與有機(jī)肥長期配施的效果最為明顯[3]。本研究結(jié)果也證明，與不施肥處理土壤相比，PSTF+OF處理能同時(shí)增加微生物量碳和微生物量氮的含量。

3.4 多年不同施肥處理對土壤酶活性的影響

土壤酶主要來自于土壤微生物代謝過程，此外也源于土壤動物和植物的分解。土壤中一切生化反應(yīng)都是在土壤酶的參與下完成的，土壤酶活性的高低能反映土壤生物活性和土壤生化反應(yīng)強(qiáng)度[38]。纖維素酶是可以表征土壤碳素循環(huán)速度的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，各種施肥處理對纖維素酶活性無顯著影響，這意味著不同施肥處理對土壤碳素循環(huán)速度的影響不顯著。脲酶能分解有機(jī)物，促其水解成氨和二氧化碳。本研究結(jié)果顯示，與水田相比，旱地中施肥處理使脲酶活性顯著提高，而在水田中各處理對脲酶活性的影響均不顯著。脫氫酶常被認(rèn)為是土壤微生物活性的一個(gè)有效指標(biāo)，其活性可以表征土壤腐殖質(zhì)化強(qiáng)度和有機(jī)質(zhì)積累的程度[39]。本研究結(jié)果顯示，PSTF+OF處理能顯著提高脫氫酶和過氧化氫酶活性。由此可見，長期施肥對土壤酶活性有很大的影響，其原因可能是長期施肥改變了土壤微生物量、區(qū)系組成，以及代謝過程，從而影響土壤酶的數(shù)量和活性[3]。

致謝:承蒙浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院張國平教授審閱并提出寶貴意見，在此深表謝意!

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