精胺誘導(dǎo)煙草愈傷組織的研究

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(1.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市公司， 廣西 百色 533000； 2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 南寧 530004)

煙草的愈傷組織(callus)不僅是獲得再生植株，而且是獲得遺傳變異，進(jìn)行農(nóng)藝性狀改良的重要材料。同時(shí)，煙草作為植物生物技術(shù)研究的常用模式植物，其愈傷組織還是細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因?qū)W等基礎(chǔ)研究的重要試驗(yàn)材料。所以，國(guó)內(nèi)外涉及如何獲得煙草愈傷組織的技術(shù)研究報(bào)告頗多。梳理相關(guān)研究報(bào)告可以發(fā)現(xiàn)：現(xiàn)有獲得煙草愈傷組織的方法中，外植體多用葉片；基本培養(yǎng)基絕大多數(shù)是用MS(Murashige和Skoog,1962)，偶爾有用H(Bourgin和Nitsch,1967)；而誘導(dǎo)劑則幾乎全部都是局限于兩類(lèi)5種植物生長(zhǎng)物質(zhì),即生長(zhǎng)素類(lèi)(auxins)中的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸) 3種及細(xì)胞分裂素類(lèi)(cytokinins)中的BA(N6-芐基腺嘌呤)和KT(激動(dòng)素) 2種。而且，往往是必須同時(shí)用其中的2種，甚至是幾種(生長(zhǎng)素類(lèi)和細(xì)胞分裂素類(lèi)至少各1種)進(jìn)行復(fù)配使用，才能達(dá)到誘導(dǎo)愈傷組織的效果。例如：余光輝等[1]和鐘林森[2]都以MS為基本培養(yǎng)基，用2,4-D 2.0+KT 0.20～0.25作誘導(dǎo)劑獲得了煙草葉片的愈傷組織；劉衛(wèi)群等[3]用2,4-D 2.0+BA 0.5獲得了“誘導(dǎo)愈傷組織的最好效果”；岳彩鵬等[4]認(rèn)為MS+NAA 1.0+BA 0.5為“誘導(dǎo)愈傷組織的最佳配方”。實(shí)踐證明，現(xiàn)有誘導(dǎo)煙草愈傷組織技術(shù)的缺陷是：外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接獲得愈傷組織速度慢，產(chǎn)量低，質(zhì)量差。且未見(jiàn)有直接用來(lái)繼續(xù)誘導(dǎo)器官再分化的，都必須及時(shí)將愈傷組織轉(zhuǎn)入由另外成分配成的專(zhuān)用繼代培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，同時(shí)還要頻繁地更新繼代培養(yǎng)基。否則，愈傷組織很快就會(huì)板結(jié)，褐化，甚至死亡。例如劉衛(wèi)群等[3]是轉(zhuǎn)入MS+NAA 0.1+BA 3.0；岳彩鵬等[4]則是轉(zhuǎn)入MS+2,4-D 0.1+NAA 1.5+BA 0.3。顯然，無(wú)論是誘導(dǎo)培養(yǎng)基，還是繼代增殖培養(yǎng)基，從配制到使用，整體操作程序復(fù)雜費(fèi)工。究其原因，顯然是受制于2,4-D，NAA和IBA的毒性與殘留，特別是2,4-D原本就是一種除草劑。所以探尋對(duì)外植體材料無(wú)毒無(wú)殘留的新型愈傷組織誘導(dǎo)劑，開(kāi)辟誘導(dǎo)煙草愈傷組織新的技術(shù)途徑，是業(yè)內(nèi)人士的共同愿望。

精胺(Spermine,Spm.)屬于多胺類(lèi)(polyamine)植物生長(zhǎng)物質(zhì)中的一種[5]，是廣泛存在于植物界的純天然植物活性物質(zhì)，對(duì)培養(yǎng)物沒(méi)有毒副作用，而且作為重要的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)合成與細(xì)胞分裂。莫淑媚等[6]報(bào)導(dǎo)Spm.可以強(qiáng)化LFS(靈發(fā)素)誘導(dǎo)羅漢果不定根的發(fā)生，使組培苗根系顯得多、粗、短、壯。但是，尚未見(jiàn)有用Spm.作誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)煙草愈傷組織的報(bào)告。

1 材料和方法

1.1 材 料

煙草品種為云煙97，其種子由廣西區(qū)煙草公司百色市公司提供。精胺由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所許鴻章教授提供，重結(jié)晶品。

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)劑的配制

依常規(guī)方法，按表1配制成7組愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)pH值為5.8～6.0，滅菌，備用。

表1 煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

序號(hào)基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)劑配方(mg/L)1MSSpm.0.52MSSpm.1.03MSSpm.1.54MSSpm.2.05MSSpm.2.56MSSpm.3.07(ck)MSSpm.0.0+2,4-D0.1+NAA1.5+BA0.2

注：該誘導(dǎo)劑配方是綜合參考已有技術(shù)報(bào)告擬定。

1.2.2 葉片外植體的準(zhǔn)備

由煙草種子先獲得無(wú)菌煙草植株，當(dāng)其長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)，自上至下取第3片葉，在無(wú)菌條件下，大約切除葉柄以上2 mm和葉尖以下2 mm的部分，再沿其主脈兩側(cè)分切成大約5 mm×5 mm的方片作煙草葉片外植體(下簡(jiǎn)稱(chēng)“方片”)，備用。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

將上述備用方片取15片，隨機(jī)分為3組，每組5片。用扭力天平分別快速稱(chēng)其鮮重，計(jì)算每5個(gè)方片的平均鮮重FW1。其它備用方片依次接種于各組備用誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每組5瓶，每瓶5個(gè)方片，于實(shí)驗(yàn)室自然散射光下培養(yǎng)，溫度為(27±1)℃。從第4天起，每天定時(shí)觀察記錄愈傷組織發(fā)生情況。培養(yǎng)至第10天，每組隨機(jī)選3瓶，統(tǒng)計(jì)出愈率(%)=出愈方片數(shù)/接種葉方片數(shù)×100%，不論方片污染與否及出愈多少，記錄每組的平均出愈率。培養(yǎng)至第20天終止試驗(yàn)，每組隨機(jī)選定3瓶無(wú)污染者，除統(tǒng)計(jì)平均出愈率外，以瓶為單位統(tǒng)計(jì)：褐變率(%)=出愈方片褐變數(shù)/ 出愈方片數(shù)×100%；褐變程度：以“+”多少表示；板結(jié)率(%)=愈傷組織緊實(shí)難以增殖分化的方片數(shù)/出愈方片數(shù)×100%。最后小心去除培養(yǎng)基，稱(chēng)取培養(yǎng)物(含方片及其愈傷組織和附生物，無(wú)論褐化板結(jié)與否)的總鮮重FW2。計(jì)算平均每瓶愈傷組織凈增鮮重(產(chǎn)量，g)FW=FW2-FW1。本試驗(yàn)做3次重復(fù)，最后記錄3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

從表2可見(jiàn)： 1) 在基本培養(yǎng)基(MS)、外植體和培養(yǎng)條件都相同的情況下，培養(yǎng)10 d，在傳統(tǒng)誘導(dǎo)劑ck組中方片出愈率僅為33.3%，而在Spm.各組出愈率達(dá)46.7%～93.3%，為ck組的1.4～2.8倍。培養(yǎng)20 d終止試驗(yàn)時(shí)，ck組出愈率為73.3%，Spm.各組則達(dá)到80%～100%。2) 培養(yǎng)20 d，ck組平均每瓶愈傷組織凈重FW為2.70 g，而Spm.各組可達(dá)3.16～8.29 g，相當(dāng)于ck組的1.2倍至3.1倍。從而證明，Spm.作煙草愈傷組織誘導(dǎo)劑比之前常用誘導(dǎo)劑出愈早，生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高。

表3顯示：ck組愈傷組織褐化、板結(jié)比較嚴(yán)重，致其生長(zhǎng)慢，產(chǎn)量低，質(zhì)量差。這可能與2,4-D等成分的

表2 不同煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)劑的出愈率和產(chǎn)量對(duì)比

誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+Spm.0.5MS+Spm.1.0MS+Spm.1.5MS+Spm.2.0MS+Spm.2.5MS+Spm.3.0MS+2,4-D0.1+NAA1.5+BA0.2(ck)10d出愈率(%)46.7cd60.0bc73.3ab86.7a93.3a93.3a33.3d20d出愈率(%)80.0bc93.3ab100.0a100.0a100.0a100.0a73.3c20d愈傷組織平均鮮重(g/瓶)3.16c5.34b8.08a8.29a8.23a8.22a2.70c

注：數(shù)據(jù)后的不同小寫(xiě)字母表示處理間達(dá)到5%的顯著差異水平。下同。

表3 不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的質(zhì)量對(duì)比

誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+Spm.0.5MS+Spm.1.0MS+Spm.1.5MS+Spm.2.0MS+Spm.2.5MS+Spm.3.0MS+2,4-D0.1+NAA1.5+BA0.2(ck)20d褐變率(%)66.7a35.7b33.3b0.0c0.0c0.0c83.3a20d褐變程度+++————+++++20d板結(jié)率(%)41.7a13.3b0.0b0.0b0.0b0.0b55.6a

毒性累積有關(guān)。Spm.各組褐化、板結(jié)輕微，甚至沒(méi)有，所以出愈早，增殖快、產(chǎn)量高，質(zhì)量?jī)?yōu)。這為后續(xù)誘導(dǎo)器官再分化打下了良好基礎(chǔ)。綜合表2和表3可以看出，Spm.作為煙草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)劑，適宜添加濃度為2.0～3.0 mg/L，最佳濃度為2.0 mg/L。

需要特別說(shuō)明的是，用Spm.配制的煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，還可直接用于愈傷組織的繼代培養(yǎng)，進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，無(wú)需再另配專(zhuān)用繼代培養(yǎng)基，實(shí)際是一基多用，能顯著提高整體工作效率。

3 討 論

本研究證明Spm.能誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的發(fā)生。但是李琳[5]的研究卻證明，Spm.對(duì)半枝蓮愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有促進(jìn)作用。這2種不同的結(jié)果，可能是因?yàn)椴煌N類(lèi)的作物，對(duì)Spm.的生理反應(yīng)不同所致。若繼續(xù)求證，需要用更多種類(lèi)的植物進(jìn)行廣泛試驗(yàn)研究才能得到規(guī)律性的結(jié)果。

4 結(jié) 論

用Spm.配制煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成分簡(jiǎn)單易于配制，誘導(dǎo)愈傷組織速度快，產(chǎn)量高，質(zhì)量好，且一基多用，顯著提高整體工作效率。適宜添加濃度為2.0～3.0 mg/L，最佳濃度是2.0 mg/L。

參考文獻(xiàn)：

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