美花石斛SSR-PCR體系的優(yōu)化研究

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(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)科院旱糧研究所， 貴陽 550006)

美花石斛(D.loddigesiiRolfe)又名粉花石斛，別名小環(huán)釵、環(huán)釵斛、小黃草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，以莖用，為貴州地道藥材。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，是被《中華人民共和國藥典》(2000版)收載的石斛屬原植物之一，自古以來就被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)的藥用石斛品種，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、延年益壽等功效；用于熱病傷津、食少干嘔、病后虛弱、陰傷目暗、食欲不振、遺精、肺結(jié)核、腰膝酸軟無力等癥[1]。由于其較高的藥用價(jià)值，目前國內(nèi)外市場的需求量越來越大。但是由于美花石斛對生境要求苛刻，生長緩慢，自然繁殖率極低，再加上環(huán)境污染和大量采伐樹木，石斛賴以生存的野生生境遭到破壞，導(dǎo)致野生美花石斛資源已經(jīng)嚴(yán)重枯竭，變?yōu)闉l危植物種。

盡管當(dāng)前關(guān)于導(dǎo)致物種瀕危的原因以及應(yīng)該采取什么樣的方法和手段來有意義地保護(hù)物種等問題存在著不同的觀點(diǎn)甚至爭論[2]，但毫無疑問，遺傳多樣性對物種的生存和發(fā)展起著決定性的作用。物種保護(hù)策略和措施的制定必須建立在對物種多樣性水平和居群遺傳結(jié)構(gòu)充分了解的基礎(chǔ)上。

目前研究植物遺傳多樣性和居群結(jié)構(gòu)最常用的檢測方法是采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，特別是以電泳和PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記展現(xiàn)了良好的優(yōu)越性，尤其是SSR標(biāo)記(Simple Sequence Repeats)，呈孟德爾方式遺傳的共顯性標(biāo)記，揭示的多態(tài)性高，重復(fù)性好，被廣泛用于遺傳多樣性檢測?；诖?，本研究擬采用正交設(shè)計(jì)方法，通過對影響PCR反應(yīng)的5大因素組合優(yōu)化，建立美花石斛的SSR-PCR成熟檢測體系，為美花石斛的種質(zhì)資源評價(jià)和遺傳多樣性分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料來自貴州省興義市清水河居群，經(jīng)花期鑒定為蘭科石斛屬植物美花石斛(D.loddigesiiRolfe)。

1.2 材料與引物

用于SSR-PCR反應(yīng)的10×Buffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTP來自大連寶生物有限公司；SSR引物序列來自于NCBI公共數(shù)據(jù)庫，初步篩選后，選擇條帶清晰的CXY 06作為本次正交試驗(yàn)的供試引物，該引物的前引物與后引物序列：F:5’GAAAAGCAATCCAACAAC 3’ R:5’GTAAAGGAGAATAATGACC 3’。

1.3 基因組DNA的提取

選取幼嫩的葉片，采用CTAB改良法[3-4]提取石斛基因組DNA，利用核酸蛋白測定儀測定DNA樣本的濃度，用1%的瓊脂糖檢測提取DNA的質(zhì)量。

1.4 美花石斛SSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對影響反應(yīng)的5個(gè)因素Mg2+、dNTP、Taq酶、Primer、模板DNA，采用正交設(shè)計(jì)L16(45)進(jìn)行試驗(yàn)，各因素水平見表1，共16個(gè)反應(yīng)體系，2次重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表1 PCR反應(yīng)因素水平

因素水平1234Mg2+(mmol/L)2.02.53.03.5dNTP(mmol/L)0.10.20.30.4Taq酶(U)0.50.751.01.5Primer(μmol/L)0.10.20.30.4DNA模板(ng)10203040

1.5 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的檢測

PCR反應(yīng)在美國Bio-Rad伯樂T 100 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序見表3，采用6%的聚丙烯酰胺測序膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，銀染，讀帶。

1.6 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

從美花石斛引物中，選取多態(tài)性較好的引物CXY 01(F:5’GATAACGCAAGAGGAAAC 3’，R:5’ATGGCTCAAACTGTAGGC 3’)，對5個(gè)不同居群的美花石斛的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過電泳檢測，以驗(yàn)證優(yōu)化的美花石斛SSR-PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性。

表2 PCR反應(yīng)L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理組合因素及水平Mg2+(mmol/L)dNTP(mmol/L)Taq酶(U)Primer(μmol/L)DNA模板(ng)12.00.10.50.11022.00.20.750.22032.00.31.00.33042.00.41.50.44052.50.10.750.34062.50.20.50.43072.50.31.50.12082.50.41.00.21093.00.11.00.420103.00.21.50.310113.00.30.50.240123.00.40.750.130133.50.11.50.230143.50.21.00.140153.50.30.750.410163.50.40.50.320

表3 PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序

擴(kuò)增類型溫度(℃)時(shí)間(min)循環(huán)次數(shù)預(yù)變性9411變性941復(fù)性Tm-2～5℃230延伸722延伸7251貯存4∞

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

從正交設(shè)計(jì)的16個(gè)處理的擴(kuò)增檢測結(jié)果(圖1)可以看出，由于SSR-PCR體系的5個(gè)主要因素濃度的不同組合，在擴(kuò)增效果上表現(xiàn)出明顯的差異。處理4表現(xiàn)最佳，具有清晰穩(wěn)定的條帶，而處理1、2、3、5、6、7、8、9、14、15、16都呈現(xiàn)出條帶模糊不清晰，處理10、11、12、13雖然具有一定的條帶，但擴(kuò)增效果與處理4具有一定的差異，在實(shí)際統(tǒng)計(jì)上，可操作性不強(qiáng)。PCR擴(kuò)增體系中，5大因素各有其作用，Mg2+濃度是影響PCR結(jié)果的重要變量之一，它可以通過影響TaqDNA聚合酶的活性來影響PCR的擴(kuò)增；dNTP是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原料，適當(dāng)?shù)臐舛葧岣叻磻?yīng)的精確度，但濃度過高，錯(cuò)配幾率會提高；Taq酶數(shù)量的變化對SSR條帶強(qiáng)弱影響較大，濃度過高時(shí)也會出現(xiàn)更多的特異性條帶；隨著引物濃度的升高，擴(kuò)增條帶會逐漸增加；DNA與引物濃度有相同的變化規(guī)律，且模板濃度高時(shí)，有時(shí)背景則會較重[5]。因此，充分考慮各個(gè)主要因素，選擇最佳的處理組合是下一步分子檢測的關(guān)鍵所在。綜合考慮各因素，處理4為最佳組合，即2.0 mmol/L Mg2+，0.4 mmol/L dNTPs，1.5 UTaq酶，0.4μmol/L引物，40 ng模板DNA。

圖2 SSR標(biāo)記CXY 02對不同居群的美花石斛的擴(kuò)增電泳圖

2.2 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

為了檢測利用供試引物篩選獲得的最優(yōu)反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果，進(jìn)一步選用CXY 02引物，應(yīng)用上述獲得的反應(yīng)體系對美花石斛5個(gè)不同居群的48株樣品的DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用6% PAGE膠檢測，都可獲得清晰可讀的條帶(圖2)，說明該體系具有較好的穩(wěn)定性和通用性，可用于美花石斛遺傳多樣性的SSR標(biāo)記分析。

3 討 論

SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化是開展遺傳分析的關(guān)鍵。目前，開展SSR-PCR優(yōu)化的報(bào)道已廣泛在苦參[6]、甘草[7]、菊花[8]、莪術(shù)[9]等藥用植物中報(bào)道過，但關(guān)于美花石斛的SSR-PCR體系優(yōu)化還未見報(bào)道。PCR反應(yīng)體系是一個(gè)綜合的多因素體系，不僅要考慮單個(gè)組分在PCR體系中發(fā)揮的作用，還要綜合考慮組分之間的互作影響。有部分研究者對SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化采用了單因素的梯度實(shí)驗(yàn)法，該方法雖然具有一定的參考作用，但是費(fèi)時(shí)且成本高，最大的缺點(diǎn)是不能反映各因素間的互作影響。因此，此方法設(shè)計(jì)具有一定的局限性。本研究中采用L16(45)正交設(shè)計(jì)表對影響PCR反應(yīng)體系的5大因素的4個(gè)水平共計(jì)16個(gè)處理進(jìn)行了優(yōu)化對比，最終獲得處理4(2.0 mmol/L Mg2+，0.4 mmol/L dNTP，1.5 UTaq酶，0.4μmol/L引物，40 ng模板DNA)具有較好的檢測效果。獲得的SSR-PCR最佳反應(yīng)體系可為今后的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、基因定位、物種鑒定及遺傳圖譜構(gòu)建奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

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