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    古茶樹優(yōu)系品種氨基酸分析

    2018-05-21 06:56:03,,,,,,,
    種子 2018年4期

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    (1.貴州大學農(nóng)學院, 貴陽 550025; 2.貴州大學園藝專業(yè)學科實驗室, 貴陽 550025; 3.貴州省茶葉研究所, 貴陽 550025; 4.都勻市科技和知識產(chǎn)權(quán)局, 貴州 都勻 558000; 5.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院, 貴州 遵義 563000; 6.國家茶及茶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(貴州), 貴州 遵義 563000; 7.貴州大學茶學院, 貴陽 550025)

    古茶樹是遺傳多樣性最豐富、最具有保存和研究價值的初級茶樹種質(zhì)資源[1]。古茶樹資源中富含的許多特異性狀,如高茶多酚、低咖啡堿、高茶氨酸、高抗性基因源、茶黃素形成能力強等可以直接利用[2-4]。古茶樹作為茶樹育種的物質(zhì)基礎(chǔ),是繁育新品種的原始材料,是種質(zhì)資源的重要組成部分,是茶學領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)[5]。

    茶葉中的氨基酸是茶葉品質(zhì)的重要組成部分[6],決定茶湯滋味,與茶葉的品質(zhì)有一定的相關(guān)性,同時又是人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì),對人體疾病的預防和康復起著極為重要的作用。茶葉中氨基酸的組成、含量及其降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量變化將直接影響到茶葉的品質(zhì)、香氣和滋味,因此,測定古茶樹中氨基酸的含量和種類對古茶樹的開發(fā)利用具有重要的意義。

    植物中氨基酸的測定方法主要有甲醛滴定法[7]、凱氏定氮法[8]、分光光度法[9]、色譜法(主要有:氣相色譜法[10]、液相色譜法[11-12]、毛細管電泳色譜法[13])、電化學法[14]等。高效液相色譜法簡便、快速、靈敏,可以對茶葉中氨基酸進行定性和定量測定,是目前較常用的方法[15]。本研究以來自貴州不同地區(qū)的4個古茶樹優(yōu)系為材料,研究高效液相色譜法(HPLC)測定古茶樹氨基酸的色譜條件,并分析4個古茶樹氨基酸組分和含量,以確定一種適用于古茶樹氨基酸測定的高效液相色譜法,為合理開發(fā)利用古茶樹提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料試劑

    供試材料為貴州大學茶學實驗基地的古茶2號、古茶4號、古茶6號及古茶8號的4年生扦插茶樹春梢1芽2葉,以種植在茶學實驗基地的福鼎大白茶春梢1芽2葉作為對照(詳見表1)。

    表1 供試材料

    編號來源2遵義市正安縣4黔南州貴定縣6黔西南州興義市8黔西南州普安縣福鼎大白茶(ck)貴陽花溪

    主要試劑有氨基酸標準樣品(該標準品購買于SK Chemicals):組氨酸(L-His)、甘氨酸(L-Gly)、茶氨酸(L-Thea)、精氨酸(L-Arg)、半胱氨酸(L-Cys)、絲氨酸(L-Ser)、脯氨酸(L-Pro)、纈氨酸(L-Val)、亮氨酸(L-Leu)、丙氨酸(L-Ala)、蘇氨酸(L-Thr)、賴氨酸(L-Lys)、谷氨酸(L-GLu)、天冬氨酸(L-Asp)、苯丙氨酸(L-Phe)、絡氨酸(L-Tyr)、甲硫氨酸(L-Met)、異亮氨酸(L-Ile)。

    色譜純:乙腈、苯異硫氰酸酯。

    分析純:無水乙醇、三乙胺、鹽酸。

    1.2 儀器與設(shè)備

    主要儀器與設(shè)備為濾紙、漏斗、玻璃棒、鐵架臺、燒杯、容量瓶、微波爐、水浴鍋、三角瓶、分光光度計、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、高效液相色譜儀、超純水儀、漩渦混合器、移液槍、手動進樣器、烘箱等。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 材料處理方法

    3月中旬于貴州大學茶學實驗基地采摘試驗材料,采摘標準為1芽2葉,采摘后的每一個鮮葉材料用隨機取樣法抽取10個芽頭,并把每個材料在250 ℃左右殺青、干燥40 min后于烘箱中103 ℃烘干,密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 測定方法

    采用103 ℃恒重法測定水分[14],游離氨基酸總量采用茚三酮比色法[15],游離氨基酸的定量定性分析采用高效液相色譜法[16]。

    1.3.3 試劑配制

    1) 混合氨基酸標準溶液的配制。

    準確稱取天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、擷氨酸、甲硫氨酸、半膚氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸各0.200 0 g,用0.02 mol/L HCl溶解并定容至500 mL。配制成每種氨基酸含量為0.400 0 mg/mL的混合氨基酸標準溶液,放入4 ℃冰箱保存。

    2) 衍生試劑的配制[16]。

    用超純水、三乙胺(TEA)、異硫氰酸苯酯(PITC)、無水乙醇,按體積比1∶1∶1∶7的比例配制10 mL(使用前臨時配制)。

    3) pH=6.77硼酸緩沖液的配置。

    A液:取硼酸1.236 8 g,氯化鈉0.292 5 g混合后加水溶解,并定容至100 mL。

    B液:取硼酸鈉1.90 7 g,加水溶解并定容至100 mL。

    取A液97 mL,B液3 mL混合后即為pH為6.77的硼酸緩沖液。

    4) 18種氨基酸標準曲線標液的配制。

    準確稱取0.015,0.025,0.035,0.045,0.055,0.065 g氨基酸標準樣品至50 mL容量瓶,用0.02 mol/L鹽酸定容,配置成0.3,0.5,0.7,0.9,1.1,1.3 g/L的氨基酸標樣儲備液。分別移取10μL氨基酸標樣儲備液于離心管中,加入20μL衍生液和70μL硼酸緩沖液,渦旋混合10 s,靜置1 min后于55 ℃下加熱10 min,吸取10μL上機分析。

    5) 供試樣品溶液配制。

    精確稱取0.3 g(精確至0.001 g)茶葉試樣于50 mL帶塞的三角錐形瓶中,加入0.02 mol/L HCl,立即將錐形瓶移入沸水浴中,浸提45 min,每隔10 min搖動錐形瓶1次,浸提完畢后用脫脂棉趁熱過濾,濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用少量熱蒸餾水將殘渣洗滌2~3次,所得濾液一起并入上述50 mL容量瓶中,待濾液冷卻后用0.02 mol/L HCl溶解定容、混勻,0.45μm水系微孔濾膜過濾,待衍生化。

    表2 不同流動相處理

    處理流動相A流動相B檢測波長(nm)流速為(mL/min)柱溫(℃)進樣量(μL)處理1乙腈超純水2541.04010處理2甲醇超純水2541.04010處理3乙腈甲醇2541.04010處理4乙腈∶水=1∶3甲醇2541.04010處理50.1mol/L無水醋酸鈉∶乙腈=93∶7乙腈∶水=8∶22541.04010

    圖1 超純水與0.2 mol/L HCl溶解谷氨酸色譜圖

    6) 衍生化過程。

    分別準確吸取對照品和供試樣品溶液各10μL離心管中,加入20μL衍生液和70μL硼酸緩沖液,渦旋混合10 s,靜置1 min后于55 ℃下加熱10 min,吸取10μL上機分析。

    1.4 色譜條件及流動相

    1.4.1 色譜系統(tǒng)

    高效液相色譜儀:日本島津公司的LC-20 A HPLC

    色譜工作站:日本島津公司的LC-20 A的色譜工作站

    分析色譜柱:日本島津公司C 18柱。

    1.4.2 溶劑的選擇

    準確稱取0.02 g谷氨酸2份,一份用超純水溶解并定容至50 mL;另一份用0.2 mol/L HCl溶解定容至50 mL,然后以PITC作為衍生試劑進行衍生反應,選擇流動相A:0.1 m無水醋酸鈉(用冰醋酸調(diào)節(jié)其pH=6.5)∶乙腈=93∶7;流動相B:乙腈∶超純水=8∶2;進行梯度洗脫。

    1.4.3 流動相的篩選

    試驗采用0.2 mol/L的鹽酸作為溶劑,用谷氨酸作為檢測物質(zhì),高效液相色譜儀測定古茶樹氨基酸含量的條件為檢測器檢測波長254 nm,色譜柱流速為1.0 mL/min,柱溫是40 ℃,以強度和對稱性作為選擇指標以確定檢測氨基酸的適宜流動相。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    采用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進行常規(guī)整理,運用SPSS軟件進行相關(guān)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溶劑的選擇

    由圖1可知,超純水溶解色譜圖的強度為8.5,并且對稱性不好;鹽酸溶解色譜圖的強度為57,且對稱性好。根據(jù)出峰強度和對稱性,選擇0.2 mol/L HCl作為氨基酸的溶劑。

    2.2 流動相的選擇

    由圖2可知,5個流動相處理下出峰強度最大為流動相處理5,達110,且5個流動相處理下流動相處理5的峰對稱性比其他4個處理好,流動相處理5在出峰前沒有下凹的跡象,在出峰的整個過程中沒有出現(xiàn)雙峰。因此,選取最佳的流動相為流動相A:0.1 mol/L無水醋酸鈉(pH=6.5)∶乙腈=93∶7,流動相B:乙腈∶水=8∶2。

    2.3 18種氨基酸混合標樣色譜圖分析

    從圖3可以看出,18種氨基酸混合標樣各組分之間的分離良好,分離效果滿意。而且各組分的峰型也呈現(xiàn)出良好的對稱性。分析周期為60 min,但是在30 min時18種氨基酸已經(jīng)完全分離出來。從圖形上看,該方法能夠較好地分離氨基酸組分,色譜圖形較好,在保證分離效果的同時,實現(xiàn)了較快分析的目的。

    圖2 不同流動相對谷氨酸峰值和對稱性的影響

    圖3 18種氨基酸標準樣品色譜圖

    表3 18種氨基酸混合標樣出峰順序及出峰時間表

    出峰順序 氨基酸名稱出峰時間(min)1 半胱氨酸3.362 天冬氨酸3.833 谷氨酸4.114 絲氨酸7.495 甘氨酸8.176 組氨酸9.247 精氨酸11.308 丙氨酸11.889 脯氨酸12.7010 茶氨酸17.8011 絡氨酸20.2912 纈氨酸21.6113 甲硫氨酸22.5314 蘇氨酸24.7015 異亮氨酸25.0516 亮氨酸25.5017 苯丙氨酸27.5018 賴氨酸29.63

    2.4 18種氨基酸標準曲線表

    由表4可知,相關(guān)系數(shù)在0.995 8~0.999 9之間,表明線性關(guān)系良好,該方法滿足氨基酸定量分析的要求。

    表4 18種氨基酸標準曲線表

    編號 氨基酸 標準曲線方程相關(guān)系數(shù)R1半胱氨酸y=154095x-27130.99982天冬氨酸y=54060x-16530.99973谷氨酸y=664225x-33020.99924絲氨酸y=208940x-3670.99985甘氨酸y=112424x-11060.99986組氨酸y=372677.5x-6260.99997精氨酸y=174145x-16490.99588丙氨酸y=79502x-13570.99989脯氨酸y=82207x-9350.999710茶氨酸y=46732x-14810.999811酪氨酸y=62005x-16420.999912纈氨酸y=116912.5x-9610.999313甲硫氨酸y=9021.5x-15930.999414蘇氨酸y=210917.5x-2720.998615異亮氨酸y=168177.5x-7700.999716亮氨酸y=256710x-6760.999717苯丙氨酸y=113555x-11750.999918賴氨酸y=584532x-16160.9993

    注:y為色譜圖的峰面積,x為氨基酸濃度。

    2.5 4個古茶樹春梢游離氨基酸含量分析

    由表5可知,各古茶樹的游離氨基酸總量均高于ck,4個古茶樹氨基酸含量以6號最高,8號古茶樹最低。

    從茶葉樣品中氨基酸的含量上看,不同茶樣之間的氨基酸組分含量有一定規(guī)律。在所測定的18種氨基酸中,茶氨酸的含量最高;而古茶樹6號的茶氨酸含量在4個古茶樹優(yōu)系中最高,且4個古茶樹優(yōu)系的茶氨酸均高于對照;對照的茶氨酸含量占總游離氨基酸含量的45.9%,8號古茶樹占52.2%、古茶樹4號53.3%、古茶樹2號43.8%、古茶樹6號49.1%。

    表5 檢測茶樣中游離氨基酸的含量(mg/g)

    福鼎大白茶(ck)茶樣8茶樣4茶樣2茶樣6半胱氨酸0.9180.3450.8621.0682.067天冬氨酸0.4280.3180.460.5330.618谷氨酸0.0340.0340.0550.0040.057絲氨酸0.2570.0110.1070.080.086甘氨酸0.0210.2680.1950.0990.096組氨酸0.0110.0530.0580.0070.034精氨酸0.1380.0580.1280.0350.144丙氨酸0.2710.0620.0560.1460.153脯氨酸0.3180.0510.0950.2290.249茶氨酸4.8026.0786.6845.8727.916酪氨酸1.5081.7012.4790.7241.852纈氨酸0.0560.0220.1970.08671.655甲硫氨酸1.3741.9980.7983.2331.264蘇氨酸0.0150.0630.0580.0460.053異亮氨酸0.1070.0350.0490.1770.135亮氨酸0.0270.030.0210.1290.035苯丙氨酸0.0560.5010.0960.1290.025賴氨酸0.1070.0120.1280.0260.149總量10.45311.6412.52613.40416.138

    3 結(jié)論與討論

    本實驗采取HPLC法定量分析貴州大學教學實驗茶園的2號、4號、6號、8號古茶樹優(yōu)系的游離氨基酸含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),古茶樹2號、4號、6號、8號的游離氨基酸含量和茶氨酸含量均高于對照福鼎大白,茶氨酸含量占茶葉干重5%以上,含量超過大部分茶葉茶氨酸含量[17]。茶氨酸古茶6號的游離氨基酸和茶氨酸含量最高;其中,古茶4號的茶氨酸含量占總游離氨基酸含量的53.3%,是4個古茶樹優(yōu)系中茶氨酸含量占比最高的,且高于對照福鼎大白茶,這符合茶氨酸是茶葉中含量最高的游離氨基酸的觀點[18]。本研究在測定過程中,根據(jù)篩選出的溶劑以及色譜條件,以出峰的最大強度和對稱性為依據(jù),選擇出最適合的流動相為檢測器檢測波長254 nm;色譜柱流速為1.0 mL/min, 柱溫為40 ℃;流動相A為0.1 m無水醋酸鈉∶乙腈=93∶7,流動相B為乙腈∶水=8∶2。而張健等研究表明,采用C 18色譜柱,以甲醇和0.05%體積分數(shù)的三氟乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫,流速為0.8 mL/min,紫外檢測波長為208 nm,柱溫30 ℃效果最佳[19],這可能是不同條件配合的結(jié)果。

    本研究通過優(yōu)化流動相的方法,建立了一種快速分析古茶樹優(yōu)系氨基酸種類及含量的HPLC檢測體系,該檢測方法簡便、快速,具有較好的應用前景。

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