氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響

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(天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300387)

納米材料一般指結(jié)構(gòu)單元尺寸為1～100 nm的材料，由于具有比表面積大和表面缺陷產(chǎn)生的一系列新的不同于宏觀物質(zhì)的效應(yīng)(小尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)、量子效應(yīng)和量子隧道效應(yīng))，在光學(xué)、熱學(xué)、電磁學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用研究都取得很大進(jìn)展[1-2]。隨著納米材料的廣泛應(yīng)用，其在環(huán)境中的釋放也不可避免，其中碳納米材料的使用尤為突出，其潛在的影響和生態(tài)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)引起各界的密切關(guān)注[3]。因此，在充分挖掘利用納米材料的獨(dú)特優(yōu)越性、推動(dòng)科技進(jìn)步的同時(shí)，了解納米材料對(duì)生物體的影響已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[4-5]。植物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，揭示納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其機(jī)理十分重要。納米材料對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的影響研究開始時(shí)多集中于種子萌發(fā)，地上、地下部分，植物抗氧化酶等方面[6-7]，之后逐漸深入到對(duì)植物光合作用系統(tǒng)的影響[8]以及對(duì)植物基因表達(dá)[9]、內(nèi)源激素、原生質(zhì)體和細(xì)胞影響的研究[10-12]，在重金屬脅迫下添加納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)影響等領(lǐng)域也有相應(yīng)的報(bào)道[13]。納米材料的小粒徑造就的小尺寸效應(yīng)是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素[12]。

在碳納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)的影響研究中，碳納米管對(duì)植物萌發(fā)生長(zhǎng)的影響和毒理研究已有很多報(bào)道[14-15]，但石墨烯、氧化石墨烯的研究還相對(duì)較少。選擇氧化石墨烯作為本實(shí)驗(yàn)碳納米材料，一方面由于石墨烯邊緣比氧化石墨烯鋒利，在與細(xì)胞作用的過程中更易通過物理破壞傷害細(xì)胞[16]，另一方面由于氧化石墨烯表面含有大量的親水性官能團(tuán)，分散在水中時(shí)能夠保持穩(wěn)定，表面經(jīng)過良好修飾的氧化石墨烯不論是在高鹽溶液還是在生理?xiàng)l件下都能穩(wěn)定存在，這為其在生物中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[17]。本試驗(yàn)選擇中國(guó)北方常用的冷季型草坪草高羊茅作為研究對(duì)象，探究氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，為更加合理使用碳納米材料，并探索發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律、作用機(jī)制，揭示植物對(duì)納米材料生態(tài)效應(yīng)的反饋?zhàn)饔靡约按嬖诘娘L(fēng)險(xiǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

氧化石墨烯(Graphene oxide)購(gòu)于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4～7 nm；片層直徑10～50μm；層數(shù)5～10 層；比表面積100～300 m2/g；純度>90%。

試驗(yàn)土壤取自天津師范大學(xué)院內(nèi)0～20 cm的表層土壤，自然風(fēng)干、碾碎、過篩、備用。土壤質(zhì)地為砂質(zhì)粘土，pH 值為7.45，其鹽含量0.1%，有機(jī)質(zhì)含量4.68%，全氮0.22%，全鉀45.57%，有效磷22.12 mg/kg，電導(dǎo)率為1.38×103μS/cm，飽和含水量0.56 mL/g，容重0.87 g/cm3，總孔隙度為63.21% 。

草坪草選用我國(guó)北方常見禾本科植物高羊茅(Festucaarundinacea)。

1.2 植物培養(yǎng)

采用直徑為7 cm、高為8 cm的塑料花盆，裝入200 g自然風(fēng)干后的土壤。選擇籽粒飽滿、大小均一的高羊茅種子，用3%的H2O2表面消毒10 min，無菌水沖洗3次，每次1～2 min，晾干[2]。0.25 g種子(約100粒)分別加入0.025，0.05，0.1，0.15 mg和0.2 mg氧化石墨烯混勻，即氧化石墨烯處理為0.1，0.2，0.4，0.6 mg/g和0.8 mg/g種子，以不加氧化石墨烯(0 mg/g)為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，均勻播撒于花盆中。植物培養(yǎng)期間室內(nèi)溫度 18～28 ℃，相對(duì)濕度為50%左右，光照為透入室內(nèi)的自然光(600～28 000 lx)。每天補(bǔ)充水分，保證土壤含水量為最大持水量的70%，供植物正常生長(zhǎng)所需。每天調(diào)換花盆的位置，保證受光一致。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 種子萌發(fā)參數(shù)的計(jì)算

從種子萌發(fā)開始，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，連續(xù)觀察記錄10 d至種子萌發(fā)穩(wěn)定。評(píng)價(jià)種子活力的參數(shù)包括發(fā)芽勢(shì)(GE)、萌發(fā)率(GP)、萌發(fā)速率系數(shù)(CGR)、萌發(fā)值(GV)和萌發(fā)指數(shù)(GI)[18]，計(jì)算公式：

GE(%)=萌發(fā)4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

GP(%)=n/N×100%(式中：n和N分別為萌發(fā)種子數(shù)和試驗(yàn)過程中所用種子總數(shù))；

CGR=[∑(t·n)/∑n]×100(式中：t為自萌發(fā)試驗(yàn)開始時(shí)的天數(shù)，n為在t天內(nèi)萌發(fā)的種子數(shù))；

GV=MDG×PV(式中：MDG為平均每天萌發(fā)的種子數(shù)，PV為萌發(fā)試驗(yàn)期間平均每天的最大萌發(fā)種子數(shù))；

GI=∑(Gt/Dt)(式中：Gt為時(shí)間t天的萌發(fā)種子數(shù)，Dt為萌發(fā)試驗(yàn)天數(shù))。

1.3.2 植物生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

播種30 d后，每盆隨機(jī)選取5株長(zhǎng)勢(shì)勻稱的植株，取其平均株高。之后刈割，地上部分108 ℃下殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，并稱量。地下部分，用清水洗凈，用濾紙吸去根外部的水分，80 ℃烘干至恒重，并稱量。

1.3.3 葉綠素含量的測(cè)定

稱取0.5 g新鮮葉片放入研缽中，加入純丙酮、少許碳酸鈣和石英砂研磨提取色素，用80%丙酮沖洗研缽，離心得到色素提取液，以80%丙酮為對(duì)照，分別測(cè)定663，645 nm處的光密度值，并根據(jù)公式計(jì)算葉綠素含量[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)效應(yīng)評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)法[20]，計(jì)算公式如下：

R(Xj) = (Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin)。

式中，R為隸屬函數(shù)值，Xj為第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin、Xmax分別為第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值和最大值。然后用各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加來計(jì)算綜合評(píng)定值。

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法，在p=0.05水平進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)；采用Microsoft Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響

氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響如表1所示。與對(duì)照相比，氧化石墨烯沒有顯著影響發(fā)芽率，但是顯著提高其他指數(shù)(p<0.05)?？傮w來看，0.2 mg/g氧化石墨烯處理表現(xiàn)最好，各萌發(fā)指數(shù)達(dá)到最高，與對(duì)照相比，萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)值、萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)速率系數(shù)分別提高了6.3%、20.7%、35.2%、31.6%和12.1%。對(duì)照處理除萌發(fā)率外，其它4個(gè)指數(shù)都是所有處理中最低的。

表1 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響

處理(mg/g)萌發(fā)指數(shù)萌發(fā)率(%)萌發(fā)勢(shì)(%)萌發(fā)速率系數(shù)萌發(fā)值萌發(fā)指數(shù)081.33±0.02ab55.67±0.01d7223.03±130.46c551.80±19.86d94.32±1.78e0.184.00±0.03ab76.33±0.03a7760.00±235.30ab686.83±38.88abc119.05±2.60bc0.287.67±0.02a76.33±0.01a8093.94±165.82a746.28±28.29a124.14±2.15a0.487.00±0.02ab73.33±0.02ab8007.88±176.59a728.26±30.14ab122.03±2.10ab0.683.00±0.02ab72.00±0.02bc7633.94±155.48abc662.48±23.97bc116.38±1.29cd0.881.00±0.04b69.00±0.01c7426.67±308.24bc627.15±45.05c113.04±2.21d

圖1 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅株高(A)和生物量(B,C)的影響

表3 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅各指標(biāo)影響的隸屬函數(shù)分析

處理(mg/g)隸屬函數(shù)值萌發(fā)率萌發(fā)勢(shì)萌發(fā)速率系數(shù)萌發(fā)值萌發(fā)指數(shù)株高地上生物量地下生物量總?cè)~綠素綜合評(píng)定排名0000000001150.10.60.80.60.60.60.20.20.40.63.230.210.81110.8110.46.210.40.80.60.80.80.810.80.80.85.820.60.40.40.40.40.40.60.60.60.23.230.800.20.20.20.20.40.40.201.64

2.2 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅株高和生物量的影響

氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅株高和生物量的影響如圖1所示。和對(duì)照相比，氧化石墨烯顯著提高了高羊茅的株高和生物量，且隨氧化石墨烯用量的增加株高和生物量呈先增加后降低的趨勢(shì)。0.2 mg/g氧化石墨烯處理的株高和地上、地下生物量達(dá)到最大，與對(duì)照相比，分別增加了23.02%、101.55%、70.27%。

2.3 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅葉綠素含量的影響

如表2所示，添加氧化石墨烯對(duì)葉綠素a含量沒有顯著影響，但對(duì)葉綠素b的影響差異顯著，高用量的氧化石墨烯顯著降低了總?cè)~綠素含量，與對(duì)照相比，0.8 mg/g處理總?cè)~綠素含量降低了7.79%。

表2 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅葉綠素含量的影響

處理(mg/g)葉綠素a(mg/g)(FW)葉綠素b(mg/g)(FW)總?cè)~綠素(mg/g)(FW)01.429±1.337a0.482±0.408a1.912±1.558a0.11.416±0.530a0.433±0.352bc1.849±0.718ab0.21.408±1.298a0.424±0.242bc1.832±1.231ab0.41.403±0.656a0.447±0.236ab1.85±0.421ab0.61.371±0.991a0.407±0.542bc1.778±0.625b0.81.363±0.854a0.399±0.172c1.763±0.701b

2.4 氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響的效應(yīng)評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法就氧化石墨烯拌種對(duì)高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響進(jìn)行評(píng)定(表3)?？梢钥闯?，添加氧化石墨烯促進(jìn)高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，0.2 mg/g處理高羊茅綜合評(píng)定表現(xiàn)最好，排名第一。氧化石墨烯處理綜合評(píng)定排名順序依次為： 0.2，0.4，0.1，0.6，0.8，0 mg/g。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物后期生長(zhǎng)的先決條件，研究氧化石墨烯對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯使高羊茅種子萌發(fā)更快，種子活力提升，其中0.2 mg/g氧化石墨烯處理促進(jìn)效果最好。Zhang等通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，石墨烯可以滲透番茄種皮，并且添加石墨烯的種子含水量高、發(fā)芽快、發(fā)芽率高[21]。Khodakovskaya等[11]通過碳納米管處理番茄種子也得到類似的研究結(jié)果。普遍認(rèn)為，納米材料能夠提高種子對(duì)水分和氧的吸收，從而增加種子活力，促進(jìn)種子發(fā)芽[2,11,21-23]。

不同用量氧化石墨烯處理顯著增加了高羊茅株高和生物量，并呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。Zhang等也發(fā)現(xiàn)，石墨烯可顯著提高番茄株高[21]，Khodakovskaya等[11]用碳納米管處理后的番茄種子所得植株株高和鮮重顯著高于對(duì)照，呈現(xiàn)低促高抑的趨勢(shì)，說明適當(dāng)用量的氧化石墨烯可以促進(jìn)高羊茅生長(zhǎng)。

研究結(jié)果顯示，高用量的氧化石墨烯顯著降低了總?cè)~綠素含量，Hu等[24]、Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，納米材料的處理會(huì)降低植物葉綠素的含量，劉尚杰等也有類似的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)50 mg/L以上石墨烯處理的水稻與對(duì)照相比葉綠素含量明顯降低，而低用量5 mg/L處理與對(duì)照相比顯著提高[26]。

另外，對(duì)納米材料如何影響植物根生長(zhǎng)的機(jī)理進(jìn)行了較多的研究。Cheng 等的研究發(fā)現(xiàn)，25 mg/L以上的石墨烯處理顯著降低油菜根的生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)根中生長(zhǎng)素的含量下降但脫落酸的含量增加，其中5 mg/L石墨烯處理的油菜根中生長(zhǎng)素和脫落酸與對(duì)照沒有顯著差異[27]。Jiao等也認(rèn)為，氧化石墨烯通過ABA和IAA途徑影響植物的生長(zhǎng)[28]。生長(zhǎng)素和脫落酸是根系結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)的最基本的分子信號(hào)。在石墨烯誘導(dǎo)的根細(xì)胞伸長(zhǎng)過程中，激素介導(dǎo)的通路也可能起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯使高羊茅地下生物量顯著增加，可能與氧化石墨烯對(duì)生長(zhǎng)素和脫落酸的影響有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

將測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，提供了一種在多指標(biāo)測(cè)定基礎(chǔ)上對(duì)高羊茅萌發(fā)和生長(zhǎng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的途徑，避免了單一指標(biāo)的片面性，能更好地揭示高羊茅的生長(zhǎng)狀況，提高評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性；綜合評(píng)定值越大，表明該劑量的氧化石墨烯拌種對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用越明顯。

綜上所述，氧化石墨烯拌種促進(jìn)了高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，提高了種子的發(fā)芽勢(shì)和幼苗株高、生物量，但是高用量處理會(huì)降低高羊茅的總?cè)~綠素含量。采用隸屬函數(shù)法就氧化石墨烯對(duì)高羊茅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響進(jìn)行綜合評(píng)定，氧化石墨烯處理的高羊茅長(zhǎng)勢(shì)好于對(duì)照，以0.2 mg/g處理高羊茅綜合評(píng)定表現(xiàn)最好。

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