中國人GRIN2B、SNCA基因多態(tài)性與帕金森病相關幻覺的關聯(lián)分析

楊雅玲， 吳 鋼， 胡志堅， 潘 浩， 魏慧星

幻覺既是抗帕金森病藥物的一種副作用，也是疾病后期的一種表現(xiàn)。從病理生理上看，幻覺可能與中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺受體因藥物治療受到過度刺激，多巴胺/乙酰膽堿失衡及5-羥色胺能神經(jīng)元變化，尾狀核和殼核的谷氨酸、殼核的去甲腎上腺素代謝水平降低以及這些神經(jīng)遞質相互作用有關。

N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl D-Aspartate，NMDA)受體亞基(GRIN1和GRIN2)表達改變可以調節(jié)谷氨酸能釋放，導致黑質紋狀體多巴胺能的死亡，促進PD進展[1，2]。Lee等[3]在馬來西亞人群中發(fā)現(xiàn)GRIN2B rs7301328基因多態(tài)性與PD患者沖動控制和相關行為(Impulse Control and Related Behavior，ICRB)有關，研究表明CC基因型可能是ICRB的獨立危險因素。GRIN2B位于12號染色體上，參與大腦谷氨酸介導的神經(jīng)傳遞[4]。多項研究表明GRIN2B rs7301328在亞洲人群中突變率高[5，6]，因此我們研究GRIN2B rs7301328基因多態(tài)性與PD相關幻覺是否存在關聯(lián)。SNCA(Alpha-Synuclein，SNCA)廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。其正常功能尚未明瞭，但有證據(jù)表明它在神經(jīng)傳遞，突觸、神經(jīng)可塑性和脂質代謝中發(fā)揮作用，可以幫助調節(jié)多巴胺釋放。已有許多關于SNCA基因多態(tài)性與PD非運動癥狀的相關性研究[8]，中國學者也發(fā)現(xiàn)SNCA rs894278與RBD相關聯(lián)[9]，有關該位點與PD患者幻覺癥狀的遺傳多態(tài)性分析較為少見。

本課題研究GRIN2B rs7301328和SNCA rs894278位點突變在中國PD患者伴有幻覺和不伴幻覺者之間的分布特征，探討這2個基因位點變異是否與PD幻覺癥狀的遺傳易感性有關。

1 材料及方法

1.1 研究對象 100例受試者來自2014～2015 y福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診不伴癡呆且有連續(xù)就診的患者，所有患者均符合UK腦庫原發(fā)性帕金森病臨床診斷標準?；糜X的診斷依據(jù)美國神經(jīng)疾病與卒中協(xié)會(National Institute of Neurological Disease and Stroke，NINDS)和美國心理衛(wèi)生研究協(xié)會(National Institute of Mental Health，NIMH)制定的帕金森病精神病性障礙的標準[10]，為PD發(fā)生后接受多巴胺能藥物治療后出現(xiàn)；至少在診斷1 y后出現(xiàn)，幻覺癥狀反復發(fā)生，或持續(xù)1 m并排除其他疾病或非抗PD藥物所致的幻覺。其中幻覺組53例，無幻覺組47例。本研究根據(jù)首次幻覺出現(xiàn)的時間長短劃分幻覺早發(fā)型組和幻覺遲發(fā)型組，疾病持續(xù)時間不足5 y出現(xiàn)幻覺的劃為幻覺早發(fā)型組；達5 y及以上才出現(xiàn)幻覺的劃分為幻覺遲發(fā)型組，其中幻覺早發(fā)型組27例、幻覺遲發(fā)型組26例；設對照組：幻覺早發(fā)型對照組為PD發(fā)病5 y內從沒出現(xiàn)過幻覺的PD患者，幻覺遲發(fā)型對照組為PD病程達8 y或以上從未出現(xiàn)過幻覺的PD患者。全部受試者均為中國漢族人群，來自于同一地域。本項研究獲得福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。所有受試者均簽署了知情同意書。

1.2 基因檢測

1.2.1 GRIN2B多態(tài)分型檢測 用TIANamp Blood DNA Kit抽提全血DNA。引物序列：F：TTCTCCCTGCAGCCCCTTTTTA和R：CGACCCAAAGAGCATCATCACC。PCR反應體系(10 μl)：包含1x HotStarTaq buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase，1 μl樣本DNA和1 μl多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，11個循環(huán)；94 ℃變性20 s，59℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，24個循環(huán)；72 ℃最后延伸2 min，4 ℃保存。將得到的PCR產物純化后用SNaPshot進行多重單堿基延伸反應。延伸引物序列：SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCGTGGATGCCCAGGAT。將延伸產物純化后上ABI3730XL測序儀測序。編碼樣本進行基因分型確保對病例組和對照組未知。

1.2.2 SNCA多態(tài)分型檢測 引物序列：F：CTGGGTGAAATATGGCGGACAG和R：GGCCAATTCCCTATGCCAGAA C。延伸引物：SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGATAAACCATCCCACTT。后續(xù)步驟同GRIN2B多態(tài)分型檢測(見圖1、圖2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計分析，設定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。本實驗利用SNaPshot SNP分型技術對100個樣本進行10個SNP位點分型。設4個分析模型，Condominant共顯性、Dominant顯性、Recessive隱性、Allele等位基因對每個位點進行卡方分析。Logistic regression以單個位點為單位，按3個假設模型，Dominan (頻率低的等位基因為顯性)，Recessive(頻率低的等位基因為隱性)，Log-additive (疊加作用)進行關聯(lián)分析。

2 結 果

2.1 臨床基線資料的比較 幻覺組臨床資料分析：幻覺組53例為46～86歲的PD患者，平均(68.55±8.77)歲，無幻覺組47例，33～76歲，平均(59.77±8.20)歲，幻覺組的年齡和起病年齡均較無幻覺組大(P<0.001；P<0.001)；總體比較，PD患者幻覺有男性優(yōu)勢，但兩組之間無顯著性差異(P=0.087)。幻覺組日常生活能力和運動能力均較無幻覺組差，差異有顯著性(P=0.013；P=0.028)?；糜X者伴慢性便秘較多(P<0.001)，而較少出現(xiàn)異動癥(P=0.003)(見表1)。

幻覺早發(fā)型組臨床資料分析：幻覺早發(fā)型組27例，46～79歲，平均(66.78±8.28)歲，其對照組73例，33～86歲，平均(63.55±9.88)歲，兩組的年齡無明顯差異(t=1.513，P=0.134)?；糜X早發(fā)型組的起病年齡較對照組大(P=0.001)；且疾病持續(xù)時間和治療持續(xù)時間均少于對照組(P<0.001；P<0.001)。幻覺早發(fā)型組伴便秘者較多(P=0.018)，且較少出現(xiàn)異動癥(P=0.006)(見表1) 。

幻覺遲發(fā)型組的臨床資料分析：幻覺遲發(fā)型組26例，53～86歲，平均(70.38±9.05)歲，其對照組19例，45～75歲，平均(59.21±7.52)歲，兩組比較年齡差異有統(tǒng)計學意義(t=4.385，P<0.001)。幻覺遲發(fā)型組的起病年齡也大于對照組(P<0.001)。與對照組相比，幻覺遲發(fā)型組男性患者居多(P=0.018)。此外，幻覺遲發(fā)型組日常生活能力和睡眠狀況均較對照組差(P=0.001；P=0.036)，且較少出現(xiàn)異動癥(P<0.001)(見表1)。

2.2 基因多態(tài)性 GRIN2B rs7301328和SNCA rs894278的基因型及等位基因頻率在幻覺組、幻覺早發(fā)型組、幻覺遲發(fā)型組與各自的對照組之間均無顯著差異(見表2、表3)。GRIN2B和SNCA 的基因頻率在三組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)(除了SNCA 在幻覺遲發(fā)型組及其對照組中考慮受樣本量影響出現(xiàn)偏差，P=0.003)，提示研究對象來自大的群體，受自然選擇等因素影響小，資料可靠。

2.3 關聯(lián)分析

2.3.1 幻覺組與無幻覺組(見表4) 在Logistic regression校正幻覺組與無幻覺組之間具有顯著差異的年齡、起病年齡、UPDRS-Ⅱ和UPDRS-Ⅲ這些對幻覺癥狀產生有影響的因素后，在隱性模型和疊加模型下，GRIN2B rs7301328的GG基因型是PD相關幻覺的保護因素(OR’=0.246，95%CI[0.071～0.848]，P’=0.026)；OR’=0.432，95%CI[0.208～0.895]，P’=0.024)，而在顯性模型下未發(fā)現(xiàn)顯著關聯(lián)性(P’=0.132)。SNCA rs897278在三種遺傳模型下校正后與PD相關幻覺風險無顯著關聯(lián)(P’=0.250；P’=0.078；P’=0.074)。

2.3.2 幻覺早發(fā)型組與幻覺早發(fā)型對照組(見表5) 在Logistic regression校正幻覺早發(fā)型組及其對照組之間具有顯著差異的起病年齡、病程及治療持續(xù)時間，在隱性模型下，SNCA rs894278 的GG基因型是PD幻覺早發(fā)型發(fā)生幻覺的危險因素(OR’=8.281，95%CI[1.217～56.334]，P’=0.031)，而在顯性模型及疊加模型下未發(fā)現(xiàn)顯著關聯(lián)(P’=0.998，P’=0.253)。GRIN2B rs7301328在三種遺傳模型下校正后與PD幻覺早發(fā)型的幻覺風險無顯著關聯(lián)(P’=0.637；P’=0.901；P’=0.817)。

2.3.3 幻覺遲發(fā)型組與幻覺遲發(fā)型對照組(見表6) 在Logistic regression校正幻覺遲發(fā)型組及其對照組之間具有顯著差異的年齡、性別、起病年齡及UPDRS-Ⅱ后，在3種遺傳模型下均沒有發(fā)現(xiàn)相關的基因多態(tài)性增加幻覺的風險(GRIN2B rs7301328：P’=0.724，P’=0.095，P’=0.213；SNCA rs894278：P’=0.994，P’=0.129，P’=0.212)。

表1 PD患者幻覺組與無幻覺組、幻覺早發(fā)型及其對照組、幻覺遲發(fā)型及其對照組的臨床參數(shù)比較

注：定量資料用t/t’檢驗；分類資料用χ2檢驗/Fisher確切概率法檢驗。各個因素所對應的統(tǒng)計值右上方標有*，表示幻覺組和無幻覺組之間差異具有統(tǒng)計學意義；標有△，表示幻覺早發(fā)型組及其對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義；標有#，表示幻覺遲發(fā)型組及其對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義。采用雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05有統(tǒng)計學意義

表2 幻覺組、幻覺早發(fā)型和幻覺遲發(fā)型組與各自對照組GRIN2B 基因多態(tài)性分布

注：右上方標有*號表示用Fisher確切概率法檢驗

表3 幻覺組、幻覺早發(fā)型和幻覺遲發(fā)型組與各自對照組的SNCA 基因多態(tài)性分布

注：右上方標有*號表示用Fisher確切概率法檢驗

表4 幻覺組與無幻覺組PD患者的基因型多態(tài)性

注：Dominan：(突變純合+突變雜合)VS野生純合；Recessive：突變純合VS(突變雜合+野生純合)；Additive：突變純合VS野生純合；CrudeOR(95%CI)和P值為用原始Logisticregression分析基因型與幻覺關聯(lián)的統(tǒng)計值和95%可信區(qū)間；Adj-OR’(95%CI)和Adj-P’值為校正年齡、起病年齡、UPDRS-Ⅱ和UPDRS-Ⅲ后的統(tǒng)計參數(shù)和95%可信區(qū)間

表5 早發(fā)幻覺組與早發(fā)幻覺對照組PD患者的基因型多態(tài)性

注：Dominan：(突變純合+突變雜合)VS野生純合；Recessive：突變純合VS(突變雜合+野生純合)；Additive：突變純合VS野生純合；CrudeOR(95%CI)和P值為用原始Logisticregression分析基因型與幻覺關聯(lián)的統(tǒng)計值和95%可信區(qū)間；Adj- OR’(95%CI)和Adj-P’為校正起病年齡、病程、治療持續(xù)時間后的統(tǒng)計參數(shù)和95%可信區(qū)間

表6 遲發(fā)幻覺組與遲發(fā)幻覺對照組PD患者的基因型多態(tài)性

注：Dominan：(突變純合+突變雜合)VS野生純合；Recessive：突變純合VS(突變雜合+野生純合)；Additive：突變純合VS野生純合；CrudeOR(95%CI)和P值為用原始Logisticregression分析基因型與幻覺關聯(lián)的統(tǒng)計值和95%可信區(qū)間；Adj- OR’(95%CI)和Adj-P’為校正年齡、性別、起病年齡、UPDRS-Ⅱ后的統(tǒng)計參數(shù)和95%可信區(qū)間

圖1 GRIN2B rs7301328位點檢測圖

圖2 SNCA rs894278位點檢測圖

3 討 論

有將近1/3長期接受多巴胺能治療的PD患者會出現(xiàn)幻覺癥狀，以視幻覺多見，有報道PD患者視幻覺占全部幻覺類型的90%以上[11，12]。在PD診治的臨床實踐中我們常常會發(fā)現(xiàn)有些患者由于出現(xiàn)精神異常，即使調整各種藥物也很難避免，從而導致治療失敗，這些患者在遺傳基因上具有什么特質這是我們開展本課題研究的思考背景。

隨著PD持續(xù)時間的進展，許多PD患者最終也會出現(xiàn)幻覺癥狀。不能排除入選PD非幻覺者的成員隨著疾病進展出現(xiàn)幻覺的可能，為此，我們將不伴幻覺的PD對照組中病程少于5y的排除(至2015年)，以免降低檢驗效能。此外，我們還根據(jù)幻覺始發(fā)時的病程將幻覺組分為幻覺早發(fā)型組和幻覺遲發(fā)型組兩個亞組以便進行進一步研究。

綜合三組臨床基線資料比較分析(見表1)，年齡大和起病年齡大者易出現(xiàn)幻覺，幻覺癥狀受日常生活能力和運動能力的影響，而幻覺遲發(fā)癥狀還受睡眠狀況影響?；糜X者伴慢性便秘和伴高血壓者較多，而較少出現(xiàn)異動癥，考慮差異是因為年齡亦是慢性便秘和高血壓的危險因素，而異動癥多見于年輕起病的PD患者[13]。因此，PD患者的幻覺癥狀除了與年齡、病程、抗PD藥物劑量這些常常描述PD特征的因素有關，還受到起病年齡、日常生活能力、運動能力及睡眠質量的影響。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GRIN2Brs7301328的等位基因及基因型頻率在3個對照組之間均無顯著差異(見表2)。然而在調整混雜因素后我們發(fā)現(xiàn)GG基因型是PD相關幻覺的保護因素(見表4)。我們的研究首次報道了GRIN2Brs7301328多態(tài)性與PD患者幻覺風險相關，我們推測可能是由于CC基因型導致SNP中其他功能性變異以致連鎖失衡。此外，NMDA受體亞基GRIN2B還被發(fā)現(xiàn)與酒精依賴(rs1806201)[14]、精神分裂癥和雙相情感障礙(rs1019385)[15]有關，表明谷氨酸信號通路參與調節(jié)情感性精神障礙[16，17]。然而在這些研究中發(fā)現(xiàn)GRIN2B基因突變增加精神疾病風險。從病理生理上看，雙相情感障礙和精神癥狀可能與中樞興奮性神經(jīng)遞質水平的改變和NMDAR在患者的表達、分布以及功能減少有關[18，19]。因此，參與NMDA受體通路的基因可能影響情感障礙和精神癥狀。

SNCArs894278在三個對照組間的等位基因及基因型頻率也均無顯著差異(見表3)。然而在調整混雜因素后我們發(fā)現(xiàn)SNCArs894278位點增加PD患者早發(fā)幻覺風險(見表5)。1997年時研究發(fā)現(xiàn)SNCA基因突變引起帕金森病[20，21]。大多數(shù)研究表明SNCA突變常見于幻覺早發(fā)型帕金森病，且患者多表現(xiàn)為各種非運動癥狀，如自主神經(jīng)功能異常、RBD(快速眼動睡眠行為障礙)、幻覺(視幻覺多見)和認知功能障礙。只有少數(shù)病例表現(xiàn)為PD的典型表現(xiàn)，以致誤診為多系統(tǒng)萎縮[22]。我們的發(fā)現(xiàn)對于協(xié)助診斷以非運動癥狀中幻覺早期出現(xiàn)的幻覺早發(fā)型帕金森病有益。當然，我們需要更多良好匹配的大樣本來準確判斷基因型與表型的相關性。

結論：在中國人不伴癡呆帕金森病人群中，GRIN2Brs7301328的GG基因型可能是PD相關幻覺的保護因素。而SNCArs894278的GG基因型可能是幻覺早發(fā)型PD患者發(fā)生幻覺的危險因素。

[參考文獻]

[1]MandelS，GrunblattE，MaorG，etal.EarlyandlategenechangesinMPTPmicemodelofParkinson’sdiseaseemployingcDNAmicroarray[J].NeurochemicalResearch，2002，27：1231-1243.

[2]MartiM，MelaF，BianchiC，etal.Striataldopamine-NMDAreceptorinteractionsinthemodulationofglutamatereleaseinthesubstantianigraparsreticulatainvivo：oppositeroleforD1andD2receptors[J].Neurochemical，2002，83：635-644.

[3]LeeJY，LeeEK，ParkSS，etal.AssociationofDRD3andGRIN2BwithimpulsecontrolandrelatedbehaviorsinParkinson’sdisease[J].MoventDisorder，2009，24：1803- 1810.

[4]HessS，DaggettL，CronaJ，etal.CloningandfunctionalcharacterizationsofhumanheteromericN-methyl-D-aspartatereceptor[J].PharmacologyandExperimentalTherapeutics，1996，278：808-816.

[5]LiouYJ，WangYC，ChenJY，etal.AssociationanalysisofpolymorphismsintheN- -methyl-D-aspartate(NMDA)receptorsubunit2B(GRIN2B)geneandtardivedyskine-siainschizophrenia[J].PsychiatryResearch，2007，153：271-275.

[6]OhtsukiT，SakuraiK，DouH，etal.MutationanalysisoftheNMDAR2B(GRIN2B)geneinschizophrenia[J].MolecularPsychiatry，2001，6：211-216.

[7]SolanoSM，MillerDW，AugoodSJ，etal.Expressionofalpha-synuclein，parkinandubiquitincarboxy-terminalhydrolaseL1mRNAinhumanbrain：genesassociatedwithfamilialParkinson’sdisease[J].AnnalsofNeurology，2000，47(2)：201-210.

[8]ChaudhuriKR，TolosaEduardo，SchapiraHV.Non-MotorSymptomsofParkinson’sDisease[J].LancetNeurology，2006，5(3)：235-245.

[9]吳國平，萬大勇，康文巖，等.α-突觸核蛋白基因多態(tài)性與帕金森病非運動癥狀的關聯(lián) [J]. 中華神經(jīng)科雜志，2015，48(10)：870-875.

[10]RavinaB，MarderK，F(xiàn)ernandezHH，etal.DiagnosticcriteriaforpsychosisinParkinson’sdisease：reportofanNINDS，NIMHworkshop[J].MovDisord，2007，22：1062-1068.

[11]CummingsJL.NeuropsychiatriccomplicationsofdrugtreatmentofParkinson'sdisease,inParkinson’sDisease:NeurobehavioralAspects[M].NewYork：OxfordUniversitypress，USA，1992. 313-327.

[12]RamosS，OrtollJR，PaulsonGW.VisualhallucinationsassociatedwithParkinson’sdisease[J].ArchivesofNeurology，1996，53：1265-1268.

[13]MiocinovicS，SomayajulaS，ChitnisS，etal.History，applicationa，andmechanismsofdeepbrainstimulation[J].JAMANeurol，2013，70(2)：29-34.

[14]KimJH，ParkM，YangSY，etal.AssociationstudyofpolymorphismsinN-methyl-D-aspartatereceptor2Bsubunits(GRIN2B)genewithKoreanalcoholism[J].NeuroscienceResearch，2006，56：220-223.

[15]LiD，HeL.AssociationstudybetweentheNMDAreceptor2Bsubunitgeneandschizophrenia：AHugereviewandmeta-analysis[J].GeneteticMedcine，2007，9：4-8.

[16]MundoE，TharmalinghamS，NevesPereiraM，etal.EvidencethattheN-methyl-D-aspartatesubunit1receptorgene(GRIN1)conferssusceptibilitytobipolardisorder[J].MolecularPsychiatry，2003，8(2)：241-245.

[17]FallinMD，LasseterVK，AvramopoulosD，etal.Bipolardisorderandschizophrenia：a440-singlenucleotidepolymorphismscreenof64candidategenesamongAshkenaziJewishcase-parenttrios[J].AmericanJournalHumanGenetic，2005，77：918-936.

[18]CoyleJT.Theglutamatergicdysfunctionhypothesisforschizophrenia[J].HarvardReviewofPsychiatry，1996，3(5)：241-253.

[19]JavittDC，ZukinSR.Recentadvancesinthephencyclidinemodelofschizophrenia[J].TheAmericanJournalofPsychiatry，1991，148(10)：1301-1308.

[20]SingletonAB，F(xiàn)arrerM，JohnsonJ，etal.Alpha-SynucleinlocustriplicationcausesParkinson’sdisease[J].Science，2003，302(5646)：841.

[21]DudaJE，GiassonBI，MabonME，etal.ConcurrenceofalphasynucleinandtaubrainpathologyintheContursikindred[J].ActaNeuropathologica，2002，104(1)：7-11.

[22]KonnoT，RossOA，PuschmannA，etal.AutosomaldominantParkinson’sdiseasecausedbySNCAduplications[J].ParkinsonismRelatateDisorder，2016，22：S1-S6.