酸奶中雙歧桿菌濃度的快速分子檢測(cè)

趙 丹，楊禹宸，楊志峰，蘇婧暄

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800）

現(xiàn)代研究表明，腸道中的有益菌群對(duì)人類健康有重要影響，可以增強(qiáng)人體識(shí)別和排除異己的反應(yīng)、加快腸道蠕動(dòng)等[1-3]。腸道中重要的生理性菌群有乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌等[4]。在人體胃腸內(nèi)有著400多類微生物，數(shù)量超過(guò)1.0×1015個(gè)，雙歧桿菌是其中之一，它擁有加強(qiáng)免疫和防備患病的生理作用，例如，生物屏障、加強(qiáng)免疫、增強(qiáng)胃腸動(dòng)力、加快維生素分解等多類生理功效[5-6]。酸奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到大眾越來(lái)越多的關(guān)注，降低血清膽固醇水平、緩解乳糖不耐癥、控制腹瀉癥狀、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、控制炎癥性腸病以及結(jié)腸癌及防止便秘的功能都離不開(kāi)益生菌的存在[7-8]。因此，建立一種及時(shí)有效的檢測(cè)酸奶中雙歧桿菌濃度的方法對(duì)消費(fèi)者具有重要的意義。

傳統(tǒng)方法原理簡(jiǎn)單，但分離種類復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度偏低[9-11]。熒光定量PCR可以準(zhǔn)確地檢測(cè)雙歧桿菌含量，但成本較高[12-15]。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)檢測(cè)雙歧桿菌，該檢測(cè)方式是以雙歧桿菌的基因?yàn)槟０?，?yàn)證引物的可行性及靈敏度，然后再通過(guò)使用凝膠成像分析系統(tǒng)圖像分析法檢測(cè)灰度值，根據(jù)已知雙歧桿菌的濃度和灰度值進(jìn)行相關(guān)性分析，建立線性方程式[16-17]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 乳雙歧桿菌菌屬來(lái)源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；蒙牛冠益乳、天潤(rùn)酸奶、伊利大果粒、伊利優(yōu)酸乳、君樂(lè)寶每日活菌均購(gòu)自超市。

1.1.2 試劑 PCR引物，DNA Maker，TRIS，Goldeen view，EDTA，瓊脂糖，電泳緩沖液，DNA提取試劑盒全部購(gòu)自上海生工公司；氯仿、異丙醇、乙醇均為分析純。

1.1.3 主要儀器 培養(yǎng)箱、PCR儀、-20℃冰箱、冷凍離心機(jī)、滅菌鍋、電子天平、pH計(jì)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI網(wǎng)站查找的雙歧桿菌16S rDNA的特異基因序列，通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站Primer3 Input（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)引物，上游引物為：TCTGGCTCAGGATGAACGC；下游引物為：CACCGTTACACCGGGAATTC，目的擴(kuò)增區(qū)間1 500 bp。

1.2.2 酸奶中總DNA提取 在研缽中放入5 mL檸檬酸鹽溶液 （含 10.0 mg蛋白酶及 8.0%的SDS）和1 mL發(fā)酵乳混合研磨，充分混合后移入EP管中，搖動(dòng)混勻；在60℃水浴保溫30 min；拿出離心管，以13 000 r/min離心10 min，取上面液體放入新的離心管；棄上清液，用DNA提取試劑盒提取DNA，分別在260，280 nm波長(zhǎng)處評(píng)估DNA純度。-20℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增方法 利用試驗(yàn)引物，PCR擴(kuò)增體系共 25 μL。10×PCRbuffer 2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，去離子水補(bǔ)足 25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃（30 s）→56℃（30 s）→68 ℃（1.5 min）進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

通過(guò)DNA提取試劑盒進(jìn)行雙歧桿菌基因組DNA的提取，提取的DNA通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，并在260，280 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行OD260/280比值檢測(cè)，以鑒定DNA純度。經(jīng)測(cè)定，提取的DNA OD260/280比值均在1.8左右，說(shuō)明DNA純度良好。

2.2 引物特異性檢驗(yàn)

以從自制純酸奶（未添加雙歧桿菌）、純種雙歧桿菌和人工接種乳雙歧桿菌的酸奶中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)照組未添加任何DNA模板，結(jié)果顯示，對(duì)照組無(wú)條帶，表明本體系無(wú)外源DNA的干擾，能特異性擴(kuò)增出雙歧桿菌的條帶。

2.3 引物靈敏性檢驗(yàn)

為檢驗(yàn)本PCR體系的檢驗(yàn)精度，本試驗(yàn)進(jìn)行人為污染設(shè)置，即將不同濃度的雙歧桿菌接種于未污染的酸奶中，最終得到雙歧桿菌濃度為2×105cfu/mL（稀釋 5 倍），1.0×105CFU/mL（稀釋 10 倍），0.75×105cfu/mL（稀釋 15 倍），0.5×105cfu/mL（稀釋 20 倍），0.2×105cfu/mL（稀釋50倍）5種不同濃度的雙歧桿菌接種的酸奶，命名為1～5號(hào)樣品。

分別將試驗(yàn)樣品進(jìn)行DNA提取，以總基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增及電泳檢測(cè)（圖2）。PCR結(jié)果顯示，隨著樣品中雙歧桿菌含量的減少，PCR擴(kuò)增條帶亮度依次減弱，檢驗(yàn)準(zhǔn)確性降低。為了保證分子生物學(xué)手段檢測(cè)的準(zhǔn)確性，本次試驗(yàn)檢測(cè)雙歧桿菌含量的最低值為0.75×105cfu/mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)方程的建立

利用凝膠成像系統(tǒng)IMAGE對(duì)圖2中5種樣品的泳帶圖像進(jìn)行灰度值測(cè)試，以構(gòu)建雙歧桿菌濃度與電泳條帶灰度值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，形成線性方程式。圖3以雙歧桿菌濃度為縱坐標(biāo)，以灰度值為橫坐標(biāo)，得到回歸方程 y＝0.142x＋0.078，R2＝0.995。根據(jù)此線性方程式，對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行雙歧桿菌DNA的提取并擴(kuò)增、電泳，根據(jù)電泳條帶灰度值，可知樣品中雙歧桿菌的濃度。

2.5 檢測(cè)體系的應(yīng)用

速檢測(cè)酸奶中雙歧桿菌濃度，將市售的蒙牛冠益乳、天潤(rùn)酸奶、伊利大果粒、伊利優(yōu)酸乳、君樂(lè)寶每日活菌5種發(fā)酵乳應(yīng)用本體系進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的發(fā)酵乳中雙歧桿菌含量有所不同，有些產(chǎn)品（如伊利大果粒、伊利優(yōu)酸乳）中雙歧桿菌含量并未達(dá)到其產(chǎn)生生理功效的含量（表1）。

上述試驗(yàn)建立了新型的分子生物學(xué)體系，以快

表1 不同品牌酸奶中雙歧桿菌濃度的檢測(cè)

3 結(jié)論

發(fā)酵乳中蛋白和脂肪含量較高，對(duì)提取其中所含乳酸菌DNA有一定影響，本試驗(yàn)提取前處理中，加入蛋白酶E和SDS能有效水解乳蛋白，去除脂肪，以獲取高純度DNA。最終本試驗(yàn)中使用DNA均為OD260/280比值在1.8左右的高純度、高質(zhì)量DNA。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)通用引物對(duì)雙歧桿菌16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，引物設(shè)計(jì)成功，且通過(guò)無(wú)模板對(duì)照試驗(yàn)表明本體系無(wú)外源基因干擾。為了保證分子生物學(xué)手段檢測(cè)的準(zhǔn)確性，引物靈敏性試驗(yàn)表明，本試驗(yàn)體系檢測(cè)雙歧桿菌含量的最低值為0.75×105cfu/mL。

最終，本試驗(yàn)建立了基于凝膠成像系統(tǒng)灰度值的檢測(cè)體系：將待檢測(cè)發(fā)酵乳樣品進(jìn)行雙歧桿菌DNA的提取，通過(guò)通用型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)樣品的泳帶圖像進(jìn)行灰度值測(cè)試。根據(jù)線性方程式y(tǒng)＝0.142x＋0.078，R2＝0.995，可得樣品中雙歧桿菌的濃度。

將市售的5種發(fā)酵乳應(yīng)用本體系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，本試驗(yàn)體系具有操作簡(jiǎn)便、直接、節(jié)省樣本等特點(diǎn)，不同廠家生產(chǎn)的發(fā)酵乳中雙歧桿菌含量有所不同，有些產(chǎn)品中雙歧桿菌含量并未達(dá)到其產(chǎn)生生理功效的含量，消費(fèi)者購(gòu)買時(shí)需謹(jǐn)慎。

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