鎘對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織抗氧化酶活性的影響

井維鑫，劉 娜，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，鎘成為水系表層沉積物中含量最高的重金屬之一[1]。水生生物通過(guò)呼吸、攝食等方式吸收環(huán)境中的重金屬，并在體內(nèi)積累[2]，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體引起慢性中毒，進(jìn)而影響人類的健康[3-6]。

雙殼類屬于底棲動(dòng)物，具有極高的濾水速率[7]，可反映水體中重金屬的污染狀況[8]，是監(jiān)測(cè)水體重金屬污染物的有效指示生物[9]。動(dòng)物組織的金屬含量與生物標(biāo)志物具有相關(guān)性[10]，鰓作為呼吸器官與水環(huán)境直接接觸，是毒物的主要靶器官[11]，重金屬通過(guò)鰓組織到達(dá)其他組織器官[12]。研究表明，鎘通過(guò)Ca2+通道穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入機(jī)體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基和活性氧（ROS），ROS與體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞膜損傷，并影響多種酶的活力，對(duì)生物體造成威脅[13]?？寡趸甘且活惐O(jiān)測(cè)環(huán)境污染或環(huán)境變化的重要生物標(biāo)志物，且在不同環(huán)境、不同物種、不同組織均有明顯差異[14]。

本研究采用亞慢性毒性試驗(yàn)方法，研究鎘暴露和鎘清除后背角無(wú)齒蚌（Anodonta woodiana）超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的變化情況，旨在為篩選合適的生物標(biāo)志物進(jìn)行重金屬監(jiān)測(cè)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

背角無(wú)齒蚌（濕質(zhì)量為（90.51±20.01）g；體長(zhǎng)為（9.08±0.64）cm；殼頂高為（3.82±0.36）cm），購(gòu)于山西省太原市五龍口水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。購(gòu)回后，用曝氣48 h的自來(lái)水清洗，去除表面附著物以及泥沙等雜質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)室條件下（水溫為（14.65±0.31）℃；溶解氧為（9.75±0.26）mg/L；電導(dǎo)率為（6.67±0.32）μS/cm；pH 值為 8.34±0.12），對(duì)背角無(wú)齒蚌馴養(yǎng)42 d，前21 d不喂食以使體內(nèi)代謝廢物排出體外，后21 d投喂小球藻（喂食數(shù)量為3.5×104個(gè) /只）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)96 hCd2+的LC50（134.9 mg/L）設(shè)置高濃度組 1.349 mg/L（1/100 LC50）和低濃度組0.337 mg/L（1/400 LC50）共 2 個(gè)鎘（Cd2+）處理組，同時(shí)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)組選取大小相近且健康的60只蚌進(jìn)行染毒。

試驗(yàn)分為2個(gè)階段：前28 d為鎘暴露期，即將背角無(wú)齒蚌在不同濃度Cd2+溶液中染毒處理28 d；后28 d為鎘清除期，將之前Cd2+染毒處理28 d的背角無(wú)齒蚌移入到清水中飼養(yǎng)至56 d。不同試驗(yàn)階段均是2 d換水一次，每次換水后進(jìn)行喂食，定時(shí)檢查蚌的死亡情況，隨時(shí)挑出死亡個(gè)體（死亡標(biāo)準(zhǔn)為貝殼長(zhǎng)久張開(kāi)，不閉合，斧足異常伸展，受刺激后不收縮[15]）。

1.2.2 樣品制備 每7 d取材一次，各試驗(yàn)組隨機(jī)取5只蚌，解剖取鰓組織，用濾紙吸凈表面水分，稱質(zhì)量后用液氮速凍后保存于-80℃冰箱中備用。同時(shí)以預(yù)冷的PBS緩沖液在冰上制備20%的鰓組織勻漿液，并于4℃下離心，取其上清液，暫保存于冰上。

1.2.3 測(cè)定方法 采用羥胺法測(cè)定T-SOD、可見(jiàn)光法測(cè)定CAT、羥胺法測(cè)定GPx、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。酶活測(cè)定的試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，抗氧化酶活力與蛋白含量的檢測(cè)用多功能酶標(biāo)儀（SpectraMaxM5，美國(guó)MD公司）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并應(yīng)用Tukey's test將處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較（?表示差異顯著（P＜0.05），?? 表示差異極顯著（P＜0.01））。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘暴露與鎘清除對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織SOD活性的影響

與對(duì)照組相比，SOD活性在背角無(wú)齒蚌鰓組織鎘暴露期的低濃度組（0.337 mg/L），21，28 d 被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01），但是 7，14 d未被抑制；高濃度組（1.349 mg/L）鎘暴露期被極顯著抑制（P＜0.01），且在 28 d抑制效果最明顯（P＜0.01）。鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）SOD活性在35 d被極顯著抑制（P＜0.01），之后隨著清除時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平；而高濃度組（1.349 mg/L）在鎘清除期內(nèi)，SOD活性被極顯著抑制（P＜0.01），且在 42 d 達(dá)最低值，其低于鎘暴露期的各組水平（圖1）。

2.2 鎘暴露與鎘清除對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織GPx活性的影響

在背角無(wú)齒蚌鰓組織中，GPx活性與對(duì)照組相比，在鎘暴露期，低濃度組（0.337 mg/L）除 21 d 無(wú)顯著性差異外，其余各組GPx活性均顯著或極顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；高濃度組（1.349 mg/L）在7 d 被極顯著抑制（P＜0.01），在 14，21，28 d 極顯著或顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），且在 21 d 達(dá)到最大值。在鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）在49，56 d 被極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01），35，42 d 無(wú)顯著性差異；高濃度組（1.349 mg/L）的鰓組織GPx活性，在 35，56 d 組被極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01），在 42，49 d無(wú)顯著性變化（圖2）。

2.3 鎘暴露與鎘清除對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓組織CAT活性的影響

鎘暴露期低濃度組（0.337 mg/L）背角無(wú)齒蚌鰓組織除7 d CAT無(wú)顯著性差異外，其他測(cè)定時(shí)間均被顯著抑制（P＜0.05）；高濃度組（1.349 mg/L）除 7 d無(wú)顯著性差異外，14，21，28 d時(shí)CAT活性顯著或極顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。鎘清除期，低濃度組（0.337 mg/L）除 56 d 無(wú)顯著性差異外，各測(cè)定時(shí)間均被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01）；高濃度組（1.349 mg/L）在 35，56 d 與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，42，49 d CAT活性均被顯著或極顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01）。在鎘清除期 56 d，低濃度組、高濃度組CAT活性均恢復(fù)至對(duì)照組水平（圖3）。

3 討論

鰓是軟體動(dòng)物的呼吸器官，是污染物作用的早期靶點(diǎn)[16]。在生物體內(nèi)，只有SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶，具有清除機(jī)體內(nèi)活性氧自由基的作用，從而使細(xì)胞免受損害[13，17-18]。研究表明，背角無(wú)齒蚌經(jīng) 4.22～67.45 mg/L Cd2+處理 24 h 后，發(fā)現(xiàn)鰓組織SOD被極顯著誘導(dǎo)[19]；經(jīng)5，50 mg/L Cd2+組脅迫14 d后鰓組織SOD活力顯著升高[20]；5 μg/L Cd2+脅迫30 d后，鰓組織由于氧化應(yīng)激，SOD活性顯著升高，40 μg/L Cd2+脅迫30 d后，SOD活性顯著下降[12]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOD活性在試驗(yàn)測(cè)定時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為被抑制，可能是因?yàn)閯?dòng)物體長(zhǎng)時(shí)間暴露在較高濃度Cd2+（0.337，1.349 mg/L）狀態(tài)下，體內(nèi)被誘導(dǎo)產(chǎn)生了較多的超氧陰離子（O2-·），而過(guò)多的O2-·影響了SOD基因的表達(dá)，進(jìn)而促使酶蛋白的合成受阻、酶活性下降[21]。

GPx是生物體普遍存在的一種抗氧化物酶。Cd2+與GPx的活性部位硒代（半）胱氨酸（Se-Cys）結(jié)合，一方面降低了Cd2+對(duì)機(jī)體的毒性影響，另一方面導(dǎo)致其活性部位發(fā)生改變、GPx失活[22]。此外，Cd2+與GPx前體結(jié)合使GPx的合成受到抑制，從而導(dǎo)致H2O2，OH-的積累，使機(jī)體受到損傷[23]。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，背角無(wú)齒蚌以5 μg/L Cd2+脅迫30 d后，鰓組織GPx活性顯著升高，40 μg/L Cd2+脅迫30 d后，GPx活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異[12]；以 4.22～67.45 mg/L Cd2+處理24 h發(fā)現(xiàn)，鰓組織GPx活性僅在16.82 mg/L Cd2+處理組表現(xiàn)為顯著升高，其余濃度組與對(duì)照組無(wú)明顯差異[19]。本試驗(yàn)在鎘暴露7 d后，高濃度組（1.349 mg/L）活性相對(duì)于對(duì)照組顯著上升，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)，GPx活性略有下降，但相對(duì)于對(duì)照組仍表現(xiàn)為顯著升高。原因是由于Cd2+進(jìn)入機(jī)體后，導(dǎo)致ROS的大量生成[24]，抑制了SOD的活性，使得機(jī)體內(nèi)H2O2的含量不斷增高，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的GPx來(lái)清除過(guò)量的H2O2[25]。

CAT是一種含血紅素的酶，存在于線粒體和抗氧化物酶體中，CAT能迅速分解H2O2，生成H2O和O2[26]。背角無(wú)齒蚌用較低濃度（5～40 μg/L）[12]或較高濃度（4.22～67.45 mg/L）[19]Cd2+脅迫后，可極顯著誘導(dǎo)鰓CAT的活性升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cd2+在0.337 mg/L 可顯著抑制 CAT活性，1.349 mg/L 可顯著誘導(dǎo)CAT活性升高。當(dāng)大量的Cd2+進(jìn)入機(jī)體并誘導(dǎo)其產(chǎn)生活性氧自由基時(shí)，SOD活性被抑制，進(jìn)而促使機(jī)體內(nèi)H2O2含量升高[24]。H2O2的升高也誘導(dǎo)了機(jī)體內(nèi)CAT的基因表達(dá)及活性，提高H2O2的分解速率[27]。

在試驗(yàn)鎘清除期56 d，鰓組織SOD活性在低濃度組（0.337 mg/L）恢復(fù)至對(duì)照組水平，而高濃度組（1.349 mg/L）仍極顯著低于對(duì)照組水平（P＜0.01）；鰓組織GPx活性低、高濃度組仍極顯著高于對(duì)照組水平（P＜0.01）；鰓組織 CAT活性低、高濃度組均恢復(fù)至對(duì)照組水平。本研究結(jié)果表明，在鎘低濃度污染被清除后，背角無(wú)齒蚌具有一定的適應(yīng)或恢復(fù)能力，而當(dāng)受外界環(huán)境高濃度鎘脅迫后，即使這種污染被清除后，機(jī)體適應(yīng)和恢復(fù)的能力也極其有限。鎘對(duì)背角無(wú)齒蚌的健康影響，在很大程度上取決于暴露劑量的高低和暴露時(shí)間的長(zhǎng)短[28]。

綜上所述，不同濃度鎘暴露后，背角無(wú)齒蚌鰓組織SOD活性被抑制，GPx活性被誘導(dǎo)，CAT活性在低濃度組中表現(xiàn)為抑制，在高濃度組中表現(xiàn)為誘導(dǎo)。表明背角無(wú)齒蚌機(jī)體對(duì)鎘污染具有一定的恢復(fù)能力。因此，背角無(wú)齒蚌抗氧化酶活性的變化能夠反映生物體受污染物脅迫的程度，可作為生物標(biāo)志物用于指示水體鎘污染狀況。

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