藜麥營養(yǎng)成分分析及黃酮提取物的抗氧化和抗菌活性研究

李玉英，王玉玲，王轉(zhuǎn)花

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西太原030006）

藜麥（Chenopodium quinoa）是原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈的藜科藜屬植物[1]，是古印加人的傳統(tǒng)糧食作物，種子顏色有白、紅、黑3種色系，具有耐寒、耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿等特性，是喜冷涼和高海拔的作物[2-3]。由于生長習(xí)性以及對種植條件要求的特殊性，不同環(huán)境下生產(chǎn)出的藜麥品質(zhì)相差極大，目前，其主要分布于南美洲，亞洲的中國山西、青海省及西北地區(qū)等。

藜麥營養(yǎng)價值極高，有營養(yǎng)黃金的美稱。藜麥中含有大量優(yōu)質(zhì)蛋白，平均為12%～23%[4]，是普通谷物的2倍及以上，可與肉蛋奶媲美，并且含有人體生長必需的所有氨基酸，其中，賴氨酸含量高于大多數(shù)谷物。藜麥富含鎂、鋅、鐵、鈣、鉀等多種礦物質(zhì)，藜麥與常見糧食作物相比，鈣、鐵含量是小麥的4倍。此外，藜麥還含有豐富的膳食纖維[5]、維生素以及包括多酚、皂苷等在內(nèi)的生物活性成分[6]，其中，黃酮類物質(zhì)被認(rèn)為是主要的功能活性成分，不僅具有抗氧化活性[7-8]，還有良好的抑菌活性[9]。RITVA等[10]研究表明，秘魯、西班牙、薩爾塞多等地藜麥的黃酮類含量在 36.2～144.3 mg/100 g；ZHU等[11]從美國托倫斯藜麥種子中分離出了6種黃酮苷元，這6種黃酮苷元在自由基清除試驗中都表現(xiàn)出很強的抗氧化活性。近年來，我國一些學(xué)者也開展了對藜麥的研究，孫雪婷等[12]以浙江本土藜麥品種Vanilla為材料，對藜麥總黃酮乙醇浸提法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在最佳條件下黃酮的得率可達(dá)2.64 mg/g。

由于藜麥豐富的營養(yǎng)價值，對藜麥中化學(xué)成分及生物活性的研究已成為國內(nèi)外食品研究領(lǐng)域的熱點，我國對于藜麥的研究起步較晚，大多集中在藜麥黃酮提取工藝優(yōu)化方面，對藜麥黃酮成分鑒定以及抗氧化和抗菌活性的研究甚少。

本研究以山西種植的藜麥種子為材料，利用地方特色資源，采用多種方法分析測定了其中的營養(yǎng)成分，并利用提取獲得的藜麥黃酮化合物進(jìn)行了抗氧化和抑菌活性研究，旨在評價藜麥的營養(yǎng)價值以及為藜麥中抗氧化物質(zhì)以及抗菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試黑色（BQ）、紅色（RQ）、白色（WQ）3種藜麥種子采自山西靜樂，系當(dāng)年收獲種子。

供試菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335），大腸桿菌（Escherichia coli，BNCC337271），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BNCC124990），均由山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室保存。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

1，1- 二 苯 基 -2 三 硝 基 苯 肼（1，1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）購自美國Sigma公司；蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)品購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸為色譜純試劑；3，5-二硝基水楊酸（DNS）、無水乙醇、濃硫酸、無水葡萄糖、碳酸鈉、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅和硫酸鉀等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

QE-250高速粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HN-36B恒溫培養(yǎng)箱（北京市恒諾利興科技有限公司）；HC-2518離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Lambda35紫外可見分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；Heto PowerDry PL3000真空冷凍干燥器（上海匯分電子科技）；HS800D恒溫水浴鍋 （太倉華利達(dá)儀器廠）；Agilent 1260系列高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麥營養(yǎng)成分分析 采用國標(biāo)方法對山西靜樂藜麥營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，蛋白質(zhì)測定采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2010）；灰分測定采用灼燒法（GB 5009.4—2010）；水分含量測定采用直接干燥法（GB 5009.3—2010）；粗脂肪測定采用索氏抽提法（GB 5009.6—2003）；氨基酸成分委托山西糧食質(zhì)量檢測中心檢測。

1.3.2 藜麥黃酮的提取制備 其參考文獻(xiàn)[13]，稍有改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取5 g干燥粉碎的藜麥樣品，石油醚索氏抽提去脂。以料液比1∶30加入1%HCl-甲醇溶液，在恒溫70℃水浴條件下回流2 h。濾渣重復(fù)上述步驟，重復(fù)提取一次，合并2次提取液，減壓抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘渣用甲醇定容至5 mL，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 黃酮含量的測定 用甲醇配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.25 mg/mL，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL，吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液 5.0 mL，加入到 5 個試管中，分別加 0.3 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，室溫下靜置5 min后再加10%硝酸鋁 0.3 mL，混勻，靜置 10 min 后，加入 2 mL 4%氫氧化鈉，然后加水補足到10 mL，混勻后放置10 min，以甲醇為空白對照，510 nm處紫外測定吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。取用甲醇稀釋后不同質(zhì)量濃度的藜麥黃酮提取液重復(fù)以上步驟，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算不同藜麥樣品中總黃酮的含量。

1.3.4 藜麥黃酮的HPLC-DAD檢測 藜麥黃酮提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣5 μL進(jìn)行分析。

用以下色譜條件進(jìn)行定量分析。色譜柱：Venusil XBP C18（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸，梯度洗脫0～10 min，45%～48%甲醇；10～30 min，48%～52%甲醇；波長為 360 nm；流速為 1.0 mL/min；柱溫為 30 ℃；進(jìn)樣量為 10 μL。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除作用測定 配制 0.05 mg/mL DPPH甲醇溶液，避光放置備用。用甲醇稀釋樣品質(zhì)量濃度分別為 0.05，0.10，0.15 mg/mL，試管中分別加入不同濃度的樣品溶液2mL，DPPH溶液2mL，充分混勻，在黑暗中避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光值（A樣品），用甲醇代替DPPH溶液測定吸光值（A對照），用甲醇代替樣品測定吸光值（A空白），以維生素C為陽性對照。試驗平行測定3次，取平均值。按公式（1）計算DPPH自由基的清除率。

1.3.5.2 羥自由基（·OH）清除率的測定 用甲醇稀釋樣品質(zhì)量濃度分別為 0.05，0.10，0.15 mg/mL，試管中分別加入不同濃度的樣品溶液2 mL，按順序先后加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL 6 mmol/L水楊酸－乙醇，2 mL 6 mmol/L H2O2，充分搖勻后在37℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，于510 nm下測量各濃度的吸光度（D樣品）。用蒸餾水代替水楊酸測得吸光度（D對照），用蒸餾水代替樣品測定吸光度（D空白）。以維生素C作為陽性對照。所有試驗均平行測定3次，取平均值，按公式（2）計算·OH清除率。

1.3.5.3 總還原力的測定 試管中依次加入1 mL不同濃度提取溶液，2.5 mL 0.2 mol/L PBS 磷酸緩沖液（pH值6.6），2.5 mL 1.0%K3（Fe（CN）6）混合置于50℃的水浴鍋中反應(yīng)20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，將混合物以3 000 r/min離心10 min。吸取2.5 mL上清液，加2.5 mL雙蒸水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻，測定樣品在 700 nm波長處的吸光度值。以維生素C作為陽性對照。結(jié)果重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.6 抗菌活性測定 依據(jù)上述3個樣品黃酮含量和抗氧化活性測定結(jié)果，選取黃酮含量和抗氧化活性都較高的BQ樣品進(jìn)行抑細(xì)菌活性測定。取供試的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行活化，加入無菌水中，制成菌懸液，借助麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)制菌濃度為107cfu/mL。采用牛津杯法測黃酮提取物的抑菌活性。采用甲醇稀釋黃酮貯備液質(zhì)量濃度分別為16，8，4 mg/mL。無菌條件下，在培養(yǎng)皿中注入20 mL培養(yǎng)基，取0.18 mL菌懸液均勻涂布于其上，將滅菌的牛津杯均勻置于平板上，然后加入0.2 mL樣液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28 h。用甲醇作為陰性對照，采用精確度為1 mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，肉眼觀察無明顯細(xì)菌生長的區(qū)域作為抑菌圈邊緣，試驗抑菌圈直徑為減去對照組后的值，結(jié)果平行測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)測定3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥營養(yǎng)成分分析

表1 藜麥基本營養(yǎng)成分分析

表2 藜麥氨基酸組成分析 g/100 g

由表1可知，藜麥中蛋白質(zhì)含量平均為12.98%，其中，WQ為 11.81%，RQ為 13.74%，BQ為 13.39%，相比于其他谷類作物大麥（11%）、水稻（7.5%），其蛋白質(zhì)含量較高，與玉米（13.4%）相當(dāng)[14-15]。藜麥中的淀粉含量在57.08%～63.37%，與其他谷物水稻（70%～80%）、玉米（65%～72%）相比，藜麥中的淀粉含量稍低。3種藜麥的水分、灰分、脂肪含量差異不大。不同顏色藜麥黃酮含量差異較大，顏色越深含量越高，最大為 3.35 mg/g。

本試驗對17種氨基酸進(jìn)行了檢測，從表2可以看出，3種藜麥的氨基酸組成的類型相差不大，但氨基酸相對含量有一定的差異。其中，BQ的氨基酸總量最高，平均為12.53 g/100 g。測定結(jié)果也顯示，藜麥中富含賴氨酸（0.25～0.35 g/100 g）、亮氨酸（1.48～1.82 g/100 g）、蛋氨酸（0.12～0.16 g/100 g）等人體生長所需的必需氨基酸。

2.2 HPLC分析藜麥黃酮的成分及含量

表3 藜麥中黃酮化合物的含量 mg/100 g

用高效液相色譜法測定藜麥種子中提取的黃酮類化合物。HPLC的分析測定結(jié)果如圖1所示，其中，（1），（2），（3），（7） 為槲皮素，（4），（5），（6），（8）為山奈酚，都是藜麥種子黃酮的主要成分。

根據(jù)HPLC的分析測定結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出2種標(biāo)品中黃酮的回歸方程。其中，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y＝ 40.028x＋4.308 7 （R2＝0.996 19）；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y＝35.649x＋3.067（R2＝0.993 6）。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算黃酮含量，結(jié)果列于表3，藜麥中槲皮素和山奈酚的含量分別為 15.06～35.25，15.56～20.46 mg/100 g。其中，RQ樣品中槲皮素含量明顯高于其他2個樣品。RITVA等[10]研究表明，不同品種藜麥的黃酮類含量在 36.2～144.3 mg/100 g；HIROSE等[16]利用高效液相色譜分析了4種藜麥黃酮苷，結(jié)果表明，日本藜麥種子黃酮的含量高于南美藜麥和日本的蕎麥，而大部分谷物類如水稻、小麥、玉米都不含有黃酮類物質(zhì)。

2.3 藜麥黃酮提取物的抗氧化活性

以Vc為陽性對照，采用3種常用的體外抗氧化活性方法（DPPH自由基清除法、羥自由基（·OH）清除法和總還原力法）對藜麥黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，3種不同顏色藜麥黃酮提取物均具有明顯的抗氧化活性，清除DPPH的IC50值（半抑制濃度）分別為 0.08，0.09，0.14 mg/mL，清除·OH的 IC50值分別為 0.08，0.10，0.15 mg/mL，BQ 和 RQ樣品清除自由基的能力強于WQ，表明顏色越深，其清除自由基的能力越強。還原力測定結(jié)果表明，3種樣品藜麥黃酮在試驗質(zhì)量濃度（0.05～0.15 mg/mL）范圍內(nèi)總還原力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，說明其具有較強的還原能力，與Vc相比，清除率略低。這一結(jié)果與上述黃酮含量測定結(jié)果也具有一定程度的一致性，整體呈正相關(guān)趨勢，表明藜麥中黃酮某些成分具有清除氧自由基抗氧化的作用。

2.4 藜麥黃酮提取物對供試菌株的抑菌效果

藜麥黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌作用通過牛津杯法進(jìn)行了檢測。由圖3可知，藜麥黃酮對各供試菌株均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，最大抑菌圈直徑分別為22，24，23 mm，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，抑菌范圍也逐漸增大，對大腸桿菌抑制效果最為明顯。

3 討論

已有研究表明，不同產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、栽培條件會影響藜麥種子營養(yǎng)成分及其抑菌性、抗氧化活性。山西省靜樂縣作為我國最大的藜麥種植生產(chǎn)縣，與種植地方小雜糧相比具有比較高的競爭優(yōu)勢。本研究以3種山西靜樂藜麥種子為材料，營養(yǎng)成分測定結(jié)果表明，其蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸含量稍有差異，但均高于小麥、水稻等傳統(tǒng)糧食作物。WRIGHT等[17]研究表明，玻利維亞的甜藜麥和苦藜麥蛋白質(zhì)含量分別為14.8%和15.7%，與本試驗測得的結(jié)果稍有不同，可能是由于不同基因型、生長環(huán)境以及檢測方法導(dǎo)致了不同產(chǎn)地藜麥中蛋白質(zhì)的差異，高海拔有利于藜麥蛋白質(zhì)品質(zhì)的提高。

藜麥中含有豐富的黃酮。許多研究表明，藜麥中黃酮和植物甾醇類物質(zhì)具有很強的抗氧化能力。ADBERRAHIM等[18]對秘魯13種有色藜麥進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，秘魯藜麥種子是酚類和黃酮類物質(zhì)的良好來源，并且抗氧化能力高于一般谷物，不同植物品種間黃酮化合物的含量差異很大[19-20]。本研究表明，山西靜樂3種藜麥中深色種子有更高黃酮含量和抗氧化活性，而常見谷物小麥、燕麥、大麥等谷物中幾乎不含有黃酮類化合物。由此可見，深色藜麥可作為一種很好的天然抗氧化劑的來源。已有研究表明，黃酮化合物具有抗真菌、抗細(xì)菌活性，本研究也發(fā)現(xiàn)，藜麥黃酮提取物對供試菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制作用，但其抑菌活性成分還需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果對于藜麥作為山西地標(biāo)特色農(nóng)產(chǎn)品的推廣種植具有一定的促進(jìn)作用，也可為我國藜麥資源的功能開發(fā)與應(yīng)用提供一定的參考。

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