系列水性環(huán)境體系中玉米離體花粉的活力解析

牛鵬飛 ，李 珍 ，馬海林 ，田承華 ，程慶軍 ，胡振鑫 ，趙 寧 ，張秦瑩 ，于美珍 ，李 南 ，閆 楓 ，屈雅娟 ，岳忠孝 ，田懷東 ，4

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西大豐種業(yè)有限公司，山西太原030031；3.山西省農業(yè)科學院高粱研究所，山西晉中030600；4.山西景康農業(yè)技術推廣有限公司，山西壽陽045400）

玉米是主要的糧食作物，在養(yǎng)殖業(yè)、釀造業(yè)、食品科學、醫(yī)藥等方面有著諸多的重要作用，在經濟發(fā)展中占有十分重要的地位[1]。近年來，隨著作物研究由基因組學轉向蛋白組學，玉米科學研究開始跨入基因功能組學與分子育種時代，為此，我們有必要通過高效的基因誘變技術開發(fā)大量的基因誘變材料[2-4]。

化學誘變主要基于烷化劑等化學誘變劑處理植株的組織器官或細胞誘發(fā)突變，因其操作簡單安全、誘變效率較高成為開發(fā)作物基因突變材料的有效途徑[5]。自NEUFFER[6]1963年首次將EMS用于玉米誘變后，經過不斷的改進完善，通過懸浮于輕質石蠟油的EMS處理玉米離體花粉進行誘變的技術獲得了成功，并應用于玉米突變體的開發(fā)[7]。玉米突變體的利用促進了一些關于玉米植株與籽粒外觀形狀的基因的功能解析，然而，絕大部分玉米的生物學功能仍然是未知的，造成這種情況的主要原因是基于低效率基因誘變技術突變材料的嚴重不足。為滿足當前及以后一段時期內玉米基因功能解析和分子育種研究對基因突變材料的大量需求，迫切需要研究高效的基因化學誘變技術[8-10]。

玉米花粉EMS石蠟油誘變技術成功解決了玉米離體花粉化學誘變的難題，然而石蠟油這樣的有機溶媒環(huán)境，明顯不利于誘變劑EMS對花粉生殖細胞的滲透與DNA的作用。我們認為這是制約玉米花粉EMS石蠟油誘變效率的主要問題。為了開發(fā)水性環(huán)境中玉米花粉生殖細胞的化學誘變處理新技術，本研究確立了保持玉米自交系離體成熟花粉活力的最優(yōu)保護液體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

將優(yōu)異玉米自交系A378種植于山西省農業(yè)科學院高粱研究所試驗研究基地，采集適量成熟玉米花粉并完成以下試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 用于離體玉米花粉處理的系列水性環(huán)境設計及其活力的顯著性分析 處于水性環(huán)境下的離體玉米花粉，受滲透壓作用，極易吸水脹破，降低活力。相關報告指出，蔗糖（Suc）[11]、甘油（Glycerol）[12]、乙二醇（EG）[13]、二甲基亞砜（DMSO）[14]4種成分對冷存狀態(tài)下的生體細胞具有各自的保護效果；玻璃化保護液處理下可顯著提高離體高粱花粉的活力[15]。據(jù)此，設計磷酸鹽溶液（PBS）與含有上述物質的3種玻璃化保護液配方（PSS），構建系列的水性環(huán)境體系。將定量提取的成熟花粉浸沒在4種水性環(huán)境體系中，以存活率評價浸沒后的花粉活力，確定玉米離體成熟花粉的最優(yōu)PSS體系。

1.2.2 最優(yōu)PSS保護下處理后玉米花粉的萌發(fā)與受精的顯微觀察 使用軟質毛筆刷將適宜置換培養(yǎng)后的離體成熟花粉輕輕蘸抹在花絲上[16]。采用苯胺藍染色，熒光顯微鏡下觀察玉米離體花粉的體外萌發(fā)狀態(tài)[17-18]。取受粉后0～24 h內若干發(fā)育時期的花絲，經適宜的FAA固定、酒精置換、NaOH軟化、苯胺藍染色、制片，使用熒光顯微鏡，觀察花粉在花絲的萌發(fā)過程。取授粉24 h后若干發(fā)育時期的胚囊，經FAA固定、酒精置換、苯胺藍染色后，再度進行酒精置換，進行雙受精及受精后細胞組織發(fā)育過程的光學顯微觀察。

1.3 測定項目及方法

使用光學顯微鏡觀察被浸沒花粉的存活狀態(tài)，采用TTC法檢測花粉活力[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件分析花粉活力變化的顯著性。

2 結果與分析

2.1 4種水性環(huán)境中離體玉米花粉存活率的解析

從表1可以看出，離體玉米花粉經不同水性環(huán)境處理后，TTC染色結果顯示，離體玉米花粉經PBS處理后，花粉出現(xiàn)大量脹破現(xiàn)象，存活率較低，僅為35.67%。經3種水性環(huán)境PSS處理后，花粉活力呈上升趨勢。各水性環(huán)境體系保持受處理玉米花粉活力的能力大小順序為PSS1＞PSS2＞PSS3＞PBS。結果表明，保護液處理后有助于提高離體玉米花粉存活率。

表1 不同水性環(huán)境處理后花粉活力的變化 %

對表1進行花粉活力變化的顯著性分析得出，磷酸鹽緩沖液（PBS）與3種保護液體系（PSS1，PSS2，PSS3）的系列水性環(huán)境下離體玉米花粉的存活率呈現(xiàn)出負相關趨勢；經過PSS處理后，3種保護液處理下的玉米離體花粉的存活率與PBS相比均有所上升。其中，PSS1，PSS2對離體花粉存活率影響均顯著，且PSS1＞PSS2，PSS3與PBS相比對離體花粉存活率的影響不顯著（圖1）。綜合分析表明，與PBS相比，PSS3對受處理花粉存活率的提高不顯著，而PSS1可顯著提高受處理花粉的存活率。

2.2 最優(yōu)PSS1處理后離體玉米花粉的萌發(fā)、受精及結籽能力的分析

圖2-A顯示，離體玉米花粉經PBS處理后，花粉顆粒吸水脹破，內容物外流，導致其失活不能被染色而呈黑色，該條件下玉米花粉存活率極低。圖2-B顯示，經最優(yōu)PSS1處理后，玉米花粉顆粒形態(tài)得到明顯改觀，能保持較完整的形態(tài)，且大部分染色為淡紅色，大大提高了離體玉米水性環(huán)境下的存活率，從形態(tài)上表明，經PSS1保護液處理后離體玉米花粉具有正常的形態(tài)及較高的活力。

將經最優(yōu)水性PSS1保護的離體玉米花粉，人工涂抹于成熟玉米花絲上，在適宜的條件下仍具備較高的萌發(fā)能力（圖3-A）。圖3-B顯示，光學顯微鏡下可觀察到大量離體玉米花粉的萌發(fā)，經水溶性苯胺藍染色后，熒光顯微鏡下可看到清晰明亮的綠白色熒光，即為萌發(fā)的花粉管。在熒光顯微鏡下觀察人工授粉后采集的各時期的樣品（圖3-C），可清晰地觀察到綠白色熒光，并觀察到花粉粒附著在花絲上，萌發(fā)出花粉管，花粉管沿花絲向下部伸長，花粉管從珠孔延伸進入子房內部（圖3-C），預示著經最優(yōu)PSS處理后的玉米離體花粉體外授粉、受精過程的順利完成。大田試驗結棒率統(tǒng)計結果顯示，自然授粉結棒率為100%；經PBS處理的玉米離體花粉結棒率13%；經最優(yōu)PSS1處理離體玉米花粉的結棒率68%。研究結果表明，最優(yōu)PSS1保護的玉米離體花粉在適宜條件下具備優(yōu)良的萌發(fā)受精能力且有較高的結實率。

3 結論與討論

玉米離體花粉處于水性環(huán)境時極易吸水脹破死亡。相關報道指出，玻璃化保護液PVS1對離體高粱花粉活力具有較明顯的保護作用[15]。本研究結果顯示，雖然受處理花粉的活力在上述水性環(huán)境中均顯著降低，但PSS中的二甲基亞砜、甘油、乙二醇、蔗糖對受處理的玉米花粉有各自的保護效果。DMSO可以減輕自由基對細胞的破壞，改變生物膜對電解質通透性，減緩水分子對細胞的作用，達到較強的滲透保護作用；Glycerol與水分子具有較強的親和性，并在細胞外壁形成保護膜來減少水分子對細胞的侵害，降低外界對其的損傷；EG具有較高的滲透作用，通過置換出自由水達到改變胞內鹽溶質濃度的作用；蔗糖的大分子量保證其不易滲透進入細胞，可以起到維持細胞內外滲透壓平衡、防止細胞過度膨脹的作用。

綜上所述，最優(yōu)PSS1保護液可顯著提高離體玉米花粉的活力，對離體玉米花粉活力的保護效果最好?；诖?，我們期望在此研究結果的基礎上，為水性溶液環(huán)境下玉米離體生殖細胞的誘變提供借鑒，開發(fā)出高效、安全的基因化學誘變新技術。本研究解決了水性環(huán)境體系下玉米離體花粉最優(yōu)保護液配方的難題，為玉米離體花粉生殖細胞化學誘變處理技術的開發(fā)奠定了基礎，對基因功能組學與分子育種研究具有重要意義。

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