河南華溪蟹2種C型凝集素原核表達及多克隆抗體的制備

趙芳芳，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

河南華溪蟹（Sinopotamon honanense）為十足類甲殼類動物，僅有先天性免疫，對環(huán)境敏感性高，是研究先天性免疫的理想物種。模式識別受體（PRRs）對病原物質(zhì)的識別是先天性免疫系統(tǒng)激活的第一步[1]。C型凝集素是一類重要的模式識別受體[2-3]，可通過其特有的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域（CTLD）結(jié)合病原體表面的糖類物質(zhì)，從而實現(xiàn)對病原體的識別[4-5]。C型凝集素在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。有關(guān)蝦蟹類C型凝集素研究表明，蝦蟹類C型凝集素具有促進吞噬、凝集、血細胞封裝及抗病菌等免疫功能[6-8]。

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王蘭課題組致力于河南華溪蟹的鎘毒性研究。鎘是存在于環(huán)境中具有蓄積性的有毒物質(zhì)[9-11]，對動物骨骼、腎臟、肝臟、肺臟、胃腸、心血管、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有毒性作用，并可致癌[12]。鎘對河南花溪蟹具有毒性作用，并影響免疫相關(guān)酶活性[13]。另外，馬文麗等[14]研究表明，鎘能誘導(dǎo)河南華溪蟹金屬硫蛋白的高效表達，何永吉等[15]曾就河南華溪蟹金屬硫蛋白進行重組融合蛋白的原核表達，并制備了兔源多克隆抗體。ShLec21與ShLec23是通過前期工作篩選并鑒定的對鎘敏感的2個基因。

本研究采用原核表達系統(tǒng)對ShLec21與ShLec23進行重組蛋白的融合表達，并制備兔源多克隆抗體，旨在為深入研究ShLec21和ShLec23基因在河南華溪蟹先天性免疫中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

日本大耳兔購自太原科鑫畜牧養(yǎng)殖場；pGEX-4T-1為山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物毒理實驗室保存；T-Vector pMD19（Simple）購于寶日醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司（北京）；克隆宿主Trans5α、表達宿主Trans BL21（DE3）pLysS購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)、T4 DNA連接酶，寶日醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司（北京）；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，NEB 有限公司（北京）；GST·BindTM，默克公司（MERCK）；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、EL-TMB顯色試劑盒、96孔板，生工生物工程股份有限公司（上海）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、羊抗兔IgG-HRP，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 ShLec21 與 ShLec23 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)前期通過RACE技術(shù)獲得的河南華溪蟹ShLec21與ShLec23基因全長，于2種C型凝集素基因5′UTR處分別設(shè)計ShLec21上游引物F1（5′-TGTGGGAGTGTCAACA GCACAGA）和 ShLec23上游引物 F2（5′-AGCACGAGACAAAGCAAAATCAT）；于 2種 C型凝集素基因 3′UTR處分別設(shè)計ShLec21 下游引物 R1（3′-ACACAATTTCGAGTCTC CGGGGT）和 ShLec23 下游引物 R2（3′-TGCTTTCA CTCATAACATCATGCT）。經(jīng)PCR獲得ShLec21與ShLec23部分基因序列（含部分5′UTR序列、3′UTR序列及完整ORF編碼序列）連接于pMD19-Tsimple質(zhì)粒，構(gòu)建重組的克隆載體pMD19-T-simple-ShLec21與pMD19-T-simple-ShLec23。隨后轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行測序。

分別在ShLec21與ShLec23開放閱讀框序列（去信號肽）5'端設(shè)計 ShLec21引物 F3（5′-CGCGG ATCCGCA TGCAATCCCGGCTTCAA）與 ShLec23引物 F4（5′-CGCGGATCCCAGACC GTAACCCCGTCT G），引入酶切位點BamHⅠ；在3′分別設(shè)計ShLec21引物 R3（3′-CCGCTCGA GTTAAAACGTCTGACAGA TGGCA）與 ShLec23 引物 R4（3′-CCGCTCGAGATT ACAACTGACAAATTGGGTAAAAG），引入酶切位點XhoⅠ。以測序正確的pMD19-T-ShLec21與pMD19-T-ShLec23為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并回收。將回收目的片段與pGEX-4T-1經(jīng)BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切回收后進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶切驗證篩選陽性克隆進行測序。

1.3.2 誘導(dǎo) ShLec21-GST與 ShLec23-GST的原核表達 將重組載體pGEX-4T-1-ShLec21與pGEX-4T-1-ShLec23與空載體分別轉(zhuǎn)入BL21（DE3）pLys表達宿主，涂于含有氨芐青霉素與氯霉素的抗性平板，挑取單克隆于5 mL LB培養(yǎng)液，200 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600為 0.6～0.8時，加入 IPTG至終濃度為 0.2 mmol/L，150 r/min，28 ℃誘導(dǎo)表達 10 h，離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解之后，12 000 r/min收集上清與沉淀。同時以誘導(dǎo)前菌液超聲破碎離心所得上清沉淀為對照，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色，鑒定蛋白表達情況。

1.3.3 包涵體融合蛋白復(fù)性純化及多克隆抗體制備 選取能夠高表達融合蛋白的菌株擴大培養(yǎng)于250 mL LB 液體培養(yǎng)基，OD600達 0.6～0.8 時，離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎離心收集沉淀即為包涵體。包涵體經(jīng)包涵體洗滌液（1%TritonX-100，5 mmol/L DTT，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl） 洗 2 次（30 min/次），4℃離心棄上清保留沉淀。包涵體溶解液 10 mL （Tris-HCl 50 mmol/L，DTT20 mmol/L，尿素8 mol/L）重懸沉淀，4℃靜置過夜溶解包涵體蛋白。12 000 r/min，4℃離心取上清，在梯度尿素（6，4，3，2，1，0 mol/L）中進行復(fù)性，每梯度濃度尿素中復(fù)性4 h。包涵體溶解蛋白復(fù)性結(jié)束后，利用GST-bind結(jié)合樹脂進行純化，Bradford法測定蛋白濃度。

將上述純化的重組ShLec21-GST與ShLec23-GST融合蛋白，分別按照 200 μg（1 mL）與 1 mL 弗氏完全佐劑混合乳化，乳化液對雌雄2只日本大耳兔于背部皮下多點注射進行基礎(chǔ)免疫?；A(chǔ)免疫14 d 后，用上述蛋白 200 μg（1 mL）與 1 mL 弗氏不完全佐劑乳化，對雌雄2只日本大耳兔進行首次加強免疫，加強免疫共3次，加強免疫之間間隔為7 d。最后一次加強免疫3 d后頸動脈采血并分離抗血清，-80℃保存?；A(chǔ)免疫前，經(jīng)耳緣靜脈采血分離陰性血清，作為對照。

1.3.4 抗 ShLec21-GST與 ShLec23-GST多克隆抗體效價測定 用間接ELISA法測定抗ShLec21-GST與 ShLec23-GST融合蛋白效價。以 1 μg/mL（100 μL/孔）包被酶標(biāo)板，4℃孵育過夜。經(jīng)洗滌、封閉、再洗滌后，加入100 μL倍比稀釋融合蛋白抗血清為一抗，37℃孵育1 h。再次洗滌，然后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG（HRP-IgG）為二抗（100 μL/孔），37℃孵育1 h。經(jīng)顯色終止，根據(jù)OD450判定結(jié)果。免疫前血清倍比稀釋代替一抗作為陰性參照。判定方法：當(dāng) P/N＞2.1 為陽性，以 P/N＞2.1 所對應(yīng)的抗體最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的效價（其中，P，N分別為陽性血清與陰性血清的OD450值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南華溪蟹 ShLec21與ShLec23原核重組表達載體的構(gòu)建

以河南華溪蟹肝胰腺組織cDNA為模板進行PCR擴增，在ShLec21預(yù)期大小555 bp及ShLec23預(yù)期大小597 bp附近分別得到單一目的條帶（圖1-A，B）。將得到的2個基因序列片段與pMD19-T-simple連接，成功構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T-simple-ShLec21與 pMD19-T-simple-ShLec23。

利用含酶切位點的引物，以pMD19-T-simple-ShLec21與pMD19-T-simple-ShLec23為模板進行PCR擴增，得到與ShLec21預(yù)期大小420 bp一致的目的條帶（圖2-A）及與ShLec23預(yù)期大小460 bp一致的目的條帶（圖2-B）。將得到的2個基因序列片段與pGEX-4T-1經(jīng)BamHⅠ，XhoⅠ雙酶切后連接，成功構(gòu)建重組原核表達載體pGEX-4T-1-ShLec21與pGEX-4T-1-ShLec23。重組 表 達 載 體 pGEX-4T-1-ShLec21，pGEX-4T-1-ShLec23經(jīng)雙酶切，分別在預(yù)期大小420，460 bp目的片段附近得到一單一條帶（圖3）。

2.2 ShLec21-GST與 ShLec23-GST重組融合蛋白的表達與純化

IPTG誘導(dǎo)含重組表達載體pGEX-4T-1-ShLec21與pGEX-4T-1-ShLec23的表達宿主原核表達2個C-型凝集融合蛋白。表達菌超聲破碎后，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分別在沉淀中約41 ku與42 ku目的條帶大小處目的蛋白被誘導(dǎo)，包涵體蛋白復(fù)性純化，得到ShLec21-GST，ShLec23-GST重組融合蛋白（圖 4）。

2.3 ShLec21-GST與 ShLec23-GST多克隆抗體效價檢測

經(jīng)間接ELISA法測定2個C型凝集素抗體效價可知，雌兔抗ShLec21-GST血清效價可達1∶512 000，雄兔抗ShLec21-GST血清中效價可達1∶256 000；雌雄兔ShLec23-GST血清中效價均可達1∶128 000（圖 5）。

3 討論

在本研究中，分別將ShLec21與ShLec23基因cDNA部分編碼序列插入pGEX-4T-1構(gòu)建重組表達載體，利用原核表達系統(tǒng)表達GST標(biāo)簽融合蛋白。pGEX-4T-1是一種用于蛋白原核表達的載體[16-17]，大小僅為4 850 bp，全序列中含有tac啟動子、谷胱氨肽轉(zhuǎn)移酶GST標(biāo)簽序列。融合標(biāo)簽的使用利于蛋白的表達和純化，同時可為目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供便利手段[18-20]。GST融合表達體系具有增加外源蛋白的可溶性；可在不同的宿主中表達，適用范圍廣；可用不同的蛋白酶方便去除；特異性高、純化方便且溫和，提高外源蛋白穩(wěn)定性以及很好保留蛋白的抗原性和生物活性，有利于抗體制備等優(yōu)點[20-22]。正是基于GST標(biāo)簽的以上優(yōu)點，本研究選擇GST融合標(biāo)簽構(gòu)建重組表達載體，表達融合蛋白，制備多克隆抗體。但是，GST標(biāo)簽也有缺點，比如重組融合蛋白不可溶，很難用變性的方法純化。

ShLec21-GST和ShLec23-GST這2種重組融合蛋白是以不可溶的包涵體形式表達的。包涵體密度高，具有易于分離純化的優(yōu)點，但不具有生物活性[23]。造成包涵體蛋白表達的原因很多。首先，蛋白質(zhì)表達量過高、合成速度快容易形成包涵體；第二，與重組蛋白的氨基酸組成有關(guān)，含硫氨基酸越多越容易形成包涵體，ShLec21-GST和ShLec23-GST這2個重組融合蛋白氨基酸序列中多處出現(xiàn)半胱氨酸，且經(jīng)預(yù)測可形成1～2個二硫鍵，這可能是造成ShLec21-GST和ShLec23-GST形成包涵體蛋白的重要因素；第三，原核表達系統(tǒng)中缺乏所需要的酶和輔助因子；另外，溫度、pH值以及培養(yǎng)基條件也是影響包涵體形成的因素[24-26]。本研究通過對河南華溪蟹2種C型凝集素包涵體蛋白進行復(fù)性純化，并免疫日本大耳兔，制備了兔源抗血清。該抗血清的獲得可為進一步研究ShLec21與ShLec23在河南華溪蟹先天性免疫中的功能打下基礎(chǔ)。

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