萱草多倍體誘導(dǎo)及其鑒定

武 江，李 麗，曹冬梅，左力翔，王云山

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031）

萱草（Hemerocallis fulva）為百合科萱草屬多年生宿根草本地被植物，其植株低矮，株型挺拔，花色艷麗，花期長(zhǎng)，抗性強(qiáng)，適栽范圍廣，觀賞和綠化價(jià)值高[1-3]。萱草屬植物根據(jù)基因型不同，分為二倍體、三倍體和四倍體。多倍體萱草因具有植株強(qiáng)壯、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、花莖粗、花大、花型多、顏色變異豐富等特點(diǎn)，在園林綠化、景觀營(yíng)造中應(yīng)用前景廣泛，也使育種者越來越關(guān)注萱草的多倍體育種。

多倍體植物具有營(yíng)養(yǎng)器官巨大、活性成分含量高、抗逆性強(qiáng)等顯著特征[4-5]，與多倍體萱草育種目標(biāo)的設(shè)定一致。多倍體育種是植物品種改良的重要手段，而組織培養(yǎng)則是植物品種保存和種性純化、擴(kuò)大栽培的有效途徑[6]?；瘜W(xué)誘變是植物多倍體誘導(dǎo)普遍采用的方法，而秋水仙素作為一種被廣泛采用且具有顯著效果的多倍體誘導(dǎo)藥劑，其對(duì)植物材料染色體結(jié)構(gòu)影響甚微，很少發(fā)生遺傳上的不利變異[7]。由于誘變劑誘導(dǎo)多倍體的不穩(wěn)定性、誘變率較低及鑒定方法的復(fù)雜性等，萱草多倍體育種進(jìn)展緩慢，有關(guān)萱草的多倍體育種鮮見報(bào)道。

本研究借助浸泡法和混培法2種誘變方法篩選適宜獲得萱草多倍體的秋水仙素濃度和愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞核DNA含量，并結(jié)合傳統(tǒng)的倍性鑒定方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立高效的萱草多倍體誘導(dǎo)體系，為萱草多倍體新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為萱草二倍體雜交品種10-154（Hemerocallis fulva 10-154），通過組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所花卉研究中心提供。該二倍體愈傷組織生長(zhǎng)健壯、組織緊密且?guī)ЬG色芽點(diǎn)。用刀片將其切成長(zhǎng)、寬、高均為0.5 cm的立方體，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

通過秋水仙素浸泡法和混培法進(jìn)行適宜濃度和培養(yǎng)時(shí)間篩選，每處理選取愈傷組織20塊，3次重復(fù)，共計(jì)60塊。通過比較存活率、形態(tài)變異率、誘變率和增殖系數(shù)，獲得最佳的處理組合。

1.2.1 浸泡法 用滅菌蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為 0 （對(duì)照），0.01% ，0.03% ，0.05% ，0.10% ，0.20% ，0.30%的秋水仙素?zé)o菌溶液，過濾，滅菌，然后將愈傷組織小塊置于溶液中，保持小塊始終處于液面之下。將液體置于轉(zhuǎn)速為80～100r/min的搖床上，分別培養(yǎng)8，16，24 h。培養(yǎng)完成后，立即將愈傷組織小塊取出，以滅菌蒸餾水沖洗4次，每次沖洗持續(xù)5 min，之后用無菌吸水紙吸干表面水分，將小塊轉(zhuǎn)接到MS＋6-BA 0.1 mg/L＋KT0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L分化培養(yǎng)基上，置于組織培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2.2 混培法 用滅菌蒸餾水配制秋水仙素溶液，加至未凝固的分化培養(yǎng)基中配制成質(zhì)量濃度分別為 0.001%，0.005%，0.020%，0.040%，0.080%的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)使之分布均勻。待培養(yǎng)基凝固后接種愈傷組織。以添加相同體積滅菌蒸餾水的分化培養(yǎng)基為對(duì)照。將培養(yǎng)基置于組織培養(yǎng)室中分別培養(yǎng)5，10，15 h。分化培養(yǎng)基與浸泡法所用培養(yǎng)基成分相同。

1.2.3 指標(biāo)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算 組織培養(yǎng)室中愈傷組織的培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光強(qiáng)為2 500 lx，光照時(shí)間為16 h/d，培養(yǎng)基pH值為5.8。試驗(yàn)進(jìn)行25 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織存活情況和不定芽增殖系數(shù)。然后將成活植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L中，15 d后統(tǒng)計(jì)形態(tài)變異率。在進(jìn)行變異率統(tǒng)計(jì)時(shí)，以形態(tài)學(xué)變異和氣孔顯著性增大作為變異的初步鑒定指標(biāo)。

存活率＝存活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；增殖系數(shù)＝不定芽新增的株數(shù)/存活的不定芽數(shù)；形態(tài)變異率＝出現(xiàn)形態(tài)變化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；誘導(dǎo)率＝染色體發(fā)生變異的植株/（存活不定芽數(shù)+增殖不定芽數(shù)）×100%。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 DNA相對(duì)含量測(cè)定 用BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀，采用Otto提取液對(duì)待測(cè)材料的根尖細(xì)胞進(jìn)行DNA相對(duì)含量測(cè)定[8-9]。

1.3.2 根尖染色體數(shù)觀察 切取再生植株的幼嫩根尖，用對(duì)二氯苯預(yù)溶液處理4.5 h，之后在4℃條件下用卡諾固定液固定24 h，在水浴鍋的環(huán)境下用l mol/L鹽酸解離10 min，解離完畢后用卡寶品紅染色液染色。每再生植株統(tǒng)計(jì)20個(gè)以上細(xì)胞，以超過85%的細(xì)胞具有恒定、一致的染色體數(shù)作為該植株的染色體數(shù)目。用Olympus-IX71倒置顯微鏡在100倍目鏡下觀察，選取染色體分散均勻的細(xì)胞拍照[10]。

1.3.3 氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞大小測(cè)定 取待測(cè)植株，將葉片小心取下，采用張秀芳等[11]的印跡法進(jìn)行氣孔鑒定。用蒸餾水清洗下表面，在該表面中部1 cm×3 cm的面積上均勻涂抹無色指甲油，干燥后將指甲油膜取下。將其與葉片接觸的一面向下，置于載玻片上并蓋好蓋玻片。在20×16倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)氣孔密度；在40×16倍鏡下測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞大小。所有材料均選取相同葉位的葉片，3次重復(fù)。

1.3.4 葉片大小測(cè)定 選取再生植株葉片，用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)度和寬度，并計(jì)算葉形指數(shù)（葉形指數(shù)＝長(zhǎng)度/寬度）。所有葉片均取自不同倍性植株相同葉位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)鄧肯式新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理萱草的最佳方法篩選

2.1.1 浸泡法對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表1可知，同一培養(yǎng)時(shí)間下，所有秋水仙素質(zhì)量濃度處理的愈傷組織存活率均顯著低于對(duì)照；在同一處理質(zhì)量濃度下，愈傷組織存活率均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低。就芽增值系數(shù)而言，不同質(zhì)量濃度處理的系數(shù)均顯著低于相同條件下對(duì)照的數(shù)值；而同一秋水仙素濃度下，處理8 h的愈傷組織不定芽增殖系數(shù)均處于較高水平，表明用秋水仙素浸泡萱草進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，并非培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。不同處理組合的愈傷組織的形態(tài)變異率比較，培養(yǎng)8 h以0.10%秋水仙素處理的最高（P＜0.05），為 52.22%；在16，24 h時(shí)具有最高形態(tài)變異率的秋水仙素處理質(zhì)量濃度則分別為0.20%和0.03%，但這2個(gè)處理的值均較0.10%秋水仙素處理下培養(yǎng)8 h的處理低。在誘導(dǎo)率方面，0.30%秋水仙素處理的愈傷組織均未發(fā)現(xiàn)染色體發(fā)生變異的植株；在8，16，24 h培養(yǎng)時(shí)間下誘導(dǎo)率最高的秋水仙素質(zhì)量濃度分別為 0.10%，0.05%，0.05%，以秋水仙素質(zhì)量濃度為0.10%、培養(yǎng)時(shí)間為 8 h的處理誘導(dǎo)率最高（35.56%）。秋水仙素質(zhì)量濃度過高或過低均使誘導(dǎo)率降低。綜合上述比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用0.10%的秋水仙素浸泡萱草愈傷組織，在培養(yǎng)8 h時(shí)愈傷組織形態(tài)變異率、多倍體誘導(dǎo)率均最高，且具有相對(duì)較高的存活率和芽增殖系數(shù)，該組合最好。

表1 秋水仙素浸泡對(duì)萱草愈傷組織形成的影響

2.1.2 混培法對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響 混培 法對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果列于表2。

表2 秋水仙素混培對(duì)萱草愈傷組織形成的影響

從表 2 可以看出，質(zhì)量濃度為 0.001%，0.005%，0.020%秋水仙素處理的萱草愈傷組織存活率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），0.040%質(zhì)量濃度下為10 h存活率最高；各處理在同一培養(yǎng)時(shí)間、不同質(zhì)量濃度下的存活率均顯著低于同期對(duì)照，有8個(gè)組合的存活率均保持在25%以上。質(zhì)量濃度為0.080%的秋水仙素處理萱草愈傷組織，不定芽增殖系數(shù)為0，說明該質(zhì)量濃度對(duì)不定芽的形成不利；培養(yǎng)5 h時(shí)，以0.040%濃度的處理增殖系數(shù)最高（P＜0.05），其他培養(yǎng)時(shí)間下以對(duì)照的增殖系數(shù)最高。就形態(tài)變異率而言，秋水仙素質(zhì)量濃度為 0.040%培養(yǎng) 10，15 h，0.080%及對(duì)照的形態(tài)變異率均為0；其他質(zhì)量濃度下，形態(tài)變異率均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；同一培養(yǎng)時(shí)間、不同濃度秋水仙素處理比較，形態(tài)變異率均以0.020%質(zhì)量濃度下最高（P＜0.05），其次是 0.005%的處理。誘導(dǎo)率是評(píng)價(jià)愈傷組織誘導(dǎo)成功率的關(guān)鍵指標(biāo)之一。由表2可知，濃度為0.005%的秋水仙素培養(yǎng)15 h具有最高的多倍體誘導(dǎo)率，其他處理均顯著低于該處理。綜合比較，認(rèn)為以0.005%的秋水仙素混培，在培養(yǎng)15 h時(shí)愈傷組織具有最高的多倍體誘導(dǎo)率和較高的存活率、芽增殖系數(shù)和形態(tài)變異率，是混培法下萱草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳組合。

2.2 細(xì)胞DNA相對(duì)含量比較

以2.1中得到的最佳愈傷組織組合誘導(dǎo)萱草多倍體植株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，篩選出變異株，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析、檢測(cè)倍性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得誘變株中既有二倍體，又有四倍體和混倍體。圖1-A為已知倍性的二倍體，在熒光強(qiáng)度45處出現(xiàn)峰值；在圖1-B中，熒光強(qiáng)度90處出現(xiàn)尖峰，說明經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)后植株的DNA相對(duì)含量是二倍體的2倍，該變異株為四倍體。

2.3 根尖染色體數(shù)比較

根尖染色體鑒定結(jié)果表明，二倍體萱草植株的細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝2x＝22（圖2-A）；對(duì)流式細(xì)胞儀鑒定出的四倍體植株的根尖染色體進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其數(shù)目為2n＝4x＝44（圖2-B），是二倍體染色體數(shù)目的2倍，進(jìn)一步確定該變異株為四倍體。染色體倍性鑒定結(jié)果與流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果一致。

2.4 氣孔性狀比較

由表3可知，四倍體植株葉片下表皮保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度、寬度均顯著高于二倍體植株，分別為二倍體植株的2.06倍和2.02倍。此外，單個(gè)視野氣孔個(gè)數(shù)以二倍體最多（P＜0.05），反映了其較高的氣孔密度，也說明四倍體植株葉片的氣孔較大。

表3 二倍體與四倍體植株氣孔特征比較

2.5 形態(tài)學(xué)比較

由表4可知，四倍體植株葉片的長(zhǎng)度和葉形指數(shù)顯著低于二倍體；而寬度則相反。對(duì)萱草二倍體及經(jīng)多倍體誘導(dǎo)得到的四倍體植株進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)四倍體較二倍體植株矮小，莖基部較粗壯，葉片較寬，葉邊呈不規(guī)則卷曲、褶皺，生長(zhǎng)較緩慢。試驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際觀察相吻合。

表4 二倍體與四倍體植株葉片特征比較

3 討論與結(jié)論

人工誘導(dǎo)多倍體是創(chuàng)建植物新種質(zhì)或新類型的一個(gè)重要途徑，也是植物育種的一個(gè)重要手段[12]。通過植物離體組織誘導(dǎo)同源四倍體已成為獲得多倍體的有效途徑[13]。不同植物材料所用的秋水仙素濃度及處理時(shí)間不盡相同，確定特定植物、組織、器官的最佳秋水仙素處理濃度及時(shí)間，需要不斷探索[14]。本研究利用秋水仙素浸泡法和混培法誘導(dǎo)愈傷組織小塊，通過秋水仙素不同濃度和培養(yǎng)時(shí)間篩選，確定了萱草愈傷組織多倍體誘變的最佳處理，經(jīng)不同方法鑒定評(píng)價(jià)，成功獲得了萱草的同源四倍體新材料，為萱草遺傳育種新途徑開發(fā)和新方法運(yùn)用奠定了基礎(chǔ)。

將化學(xué)誘變與植物組織離體培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，對(duì)植物材料遺傳變異的誘發(fā)、繁殖、改良、選擇技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿?。其不受環(huán)境條件限制，可節(jié)省時(shí)間，擴(kuò)大變異譜，提高變異率[15-16]。有研究指出，秋水仙素雖在誘導(dǎo)植物多倍體育種中應(yīng)用廣泛，效果顯著[17]，但它在使用過程中還可能存在副作用，即具有一定的毒害作用，常表現(xiàn)為對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制[18]。本試驗(yàn)中，雖然通過浸泡法和混培法篩選到了萱草愈傷組織最佳處理濃度和培養(yǎng)時(shí)間，其愈傷組織存活率在所有處理中并非最高，芽增殖系數(shù)也并非最高，但誘導(dǎo)率卻最高，說明雖然所試驗(yàn)的濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織的毒害作用存在，但仍可作為萱草多倍體誘導(dǎo)的適宜處理。

多倍體植物一般表現(xiàn)為莖粗、葉寬厚、顏色深、花大、果大、種子大而少[19]，植株“巨大性”非常明顯[20]。本研究中，四倍體與二倍體植株相比，具有較大寬度和較小的長(zhǎng)度，葉片不規(guī)則，生長(zhǎng)緩慢，與前人在其他植物上的研究結(jié)果類似[21-23]。

流式細(xì)胞儀測(cè)定法結(jié)合根尖染色體計(jì)數(shù)法是最可靠的多倍體鑒定方法。利用這2種方法結(jié)合進(jìn)行葉片下表皮單位面積的氣孔大小、密度等形態(tài)學(xué)鑒定，可從多個(gè)方面對(duì)多倍體的倍性進(jìn)行確定[24-27]。本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行萱草倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)四倍體植株的DNA相對(duì)含量為二倍體的2倍，借助根尖染色體計(jì)數(shù)法鑒定多倍體倍性，所得結(jié)果也與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致，染色體數(shù)為原二倍體的2倍。在得到四倍體萱草的同時(shí)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了流式細(xì)胞儀法檢測(cè)植物倍性的可靠性。

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