咖啡酸對(duì)輻射損傷小鼠造血調(diào)控因子表達(dá)的影響＊

杜遵民，賈海鵬，劉 靜，楊莉莉，陳方國(guó)

隨著核能及放射技術(shù)在國(guó)防和民用領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，輻射防護(hù)的研究再次成為熱點(diǎn)，造血系統(tǒng)更新活躍，對(duì)輻射高度敏感，輻射損傷后主要表現(xiàn)為不同程度的造血功能障礙［1］，是急性放射病發(fā)病的重要基礎(chǔ)及預(yù)防診治的關(guān)鍵問題。筆者早期研究［2］發(fā)現(xiàn)咖啡酸（caffeic acid，CFA）對(duì)輻射損傷小鼠造血恢復(fù)有促進(jìn)作用。該研究以X射線照射小鼠為模型，旨在觀察CFA對(duì)輻射損傷小鼠的造血調(diào)控因子粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，探討CFA促進(jìn)造血恢復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 咖啡酸原藥，山東德州德藥制藥有限公司生產(chǎn)，淡黃色，粉末狀，無臭，味微酸，水溶液呈酸性反應(yīng)，批號(hào)110301。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12～16周齡的SPF級(jí)近交系BALB/c小鼠 42只，雌雄各半，體重 25～29 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：20090001。小鼠照射前1周至照射后2周飼養(yǎng)于無菌層流室，飲水為含慶大霉素（32×104U/L）的高壓滅菌水。

1.1.3 主要儀器 X射線直線加速器，美國(guó)Rad Source Technologies公司RS2000PRO型;全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀器儀，深圳市普康電子有限公司PE－6800VET 型。小鼠血清 G－CSF、TPO、IL－1β 和 TNF－α ELISA試劑盒，上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 SPF級(jí)近交系BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組，單純照射組，CFA組，每組14只。CFA組：照射當(dāng)天開始咖啡酸100 mg/kg·d灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃至照射后 14 d；CFA灌胃液配制：因CFA不溶于水，置于水中有較多沉淀，故將CFA原藥溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉中制備成濃度10 mg/ml的混懸液，臨用前新鮮配制，一次灌0.1 ml/10 g。單純照射組：照射后當(dāng)天開始等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃;空白對(duì)照組：不照射，僅給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。

1.2.2 照射方法 照射前將小鼠置于升降操作臺(tái)上的淺底分隔木盒內(nèi)，盒內(nèi)小鼠呈輻射狀分散排列，加蓋有機(jī)玻璃固定，照射源距小鼠50 cm。受試小鼠接受X射線直線加速器一次性全身照射，吸收劑量率 1.21 Gy/min，照射時(shí)間為 223 s，照射劑量為4.5 Gy?？瞻讓?duì)照組設(shè)置類似環(huán)境，佯照射。

1.3 造血調(diào)控因子G-CSF、TPO、IL-1β和TNF-α的水平檢測(cè)每組選12只分別于照射后4 d、14 d各取6只，摘除眼球取血，室溫放置2 h，4℃冰箱內(nèi)3～4 h，待血液凝固收縮后，2500 rpm離心10 min，取上清保存于－80℃。分別嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作測(cè)定血清 G－CSF、TPO、IL－1β 和TNF－α的含量水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（采用SNK法進(jìn)行兩兩比較）進(jìn)行組間比較。 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFA對(duì)輻射后小鼠造血調(diào)控因子G-CSF、TPO、IL-1β水平的影響照射后4 d、14 d各受照組小鼠造血正性調(diào)控因子G－CSF、TPO水平較空白對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）。 照射后 4 d、14 d CFA 組小鼠G－CSF、TPO水平明顯高于單純照射組 （P＜0.05），見表 1、2。

表1 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 G-CSF 水平變化，ng/L）

表1 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 G-CSF 水平變化，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d與 4 d 比較，△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對(duì)照組 6 494.10±45.27 490.76±28.10單純照射組 6 846.56±21.29＊ 640.16±31.11＊△CFA 組 6 1523.23±93.12＊# 1773.13±103.01＊#△

表2 各組小鼠輻射后4d和14d血清TPO水平變化pg/ml）

表2 各組小鼠輻射后4d和14d血清TPO水平變化pg/ml）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d 與 4 d 比較，△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對(duì)照組 6 2252.33±74.87 2322.27±111.06單純照射組 6 3341.58±53.77＊ 3008.25±75.95＊△CFA 組 6 4436.22±110.11＊# 4769.55±123.02＊#△

照射后4 d和14 d單純照射組與CFA組小鼠IL－1β 水平均較空白對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）。 4 d單純照射組與CFA組IL－1β水平組間比較無明顯差異（P＞0.05），14 d CFA 組 IL－1β 水平高于單純照射組（P＜0.05）。 單純照射組小鼠 14 d IL－1β 水平低于 4 d（P＜0.05），而 CFA 組 14 d IL－1β 水平高于4 d（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表 3。

表3 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 IL-1β 水平變化（，ng/L）

表3 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 IL-1β 水平變化（，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d 與 4 d 比較△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對(duì)照組 6 172.02±25.49 165.78±19.58單純照射組 6 240.58±23.15＊ 208.44±16.38＊△CFA 組 6 235.42±27.31＊ 265.39±12.65＊#△

2.2 CFA對(duì)輻射后小鼠造血調(diào)控因子TNF-α水平的影響照射后4 d和14 d單純照射組與CFA組小鼠TNF－α水平均較空白對(duì)照組明顯升高 （P＜0.05），CFA 組明顯低于單純照射組 （P＜0.05）。 單純照射組小鼠 14 d TNF－α 水平高于 4 d （P＜0.05），CFA 組 14 d TNF－α 水平低于 4 d（P＜0.05），見表 4。

表4 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 TNF-α 水平變化ng/L）

表4 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 TNF-α 水平變化ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d 與 4 d 比較，△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對(duì)照組 6 450.56±34.46 457.26±25.24單純照射組 6 1285.55±89.09＊ 1678.58±110.98＊△CFA 組 6 929.13±74.79＊# 805.79±58.44＊#△

3 討論

在正常生理?xiàng)l件情況下，造血正性調(diào)控因子，如G-CSF、TPO、IL-1β和造血負(fù)性因子，如TNF-α它們組成的網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控造血干祖細(xì)胞分化、增殖、成熟和釋放、凋亡過程，并維持血細(xì)胞的數(shù)量和比例在某一穩(wěn)定水平。G-CSF是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，主要參與粒細(xì)胞的造血調(diào)控［3］；TPO主要由肝臟產(chǎn)生，少量在腎和骨髓產(chǎn)生，刺激造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化增殖、成熟，產(chǎn)生和釋放血小板，血漿 TPO水平與血小板數(shù)成負(fù)相關(guān)［4］。IL-1β主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多能造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放集落刺激因子，能促進(jìn)骨髓原始造血細(xì)胞集落增殖［3］。TNF-α是TNF受體超家族的成員之一，是由激活的單核巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的一種多效性細(xì)胞因子，可抑制骨髓CFU-GM、CFU-E 和 BFU-E 的增殖［5］。 在體內(nèi)外這些正性調(diào)控因子均能強(qiáng)烈刺激造血祖細(xì)胞增殖，分泌并形成CFU-GM、CFU-MK等細(xì)胞集落。但當(dāng)機(jī)體遭受輻射損傷后，骨髓微環(huán)境中的造血正性因子早期會(huì)增加，造血負(fù)性因子增加更為明顯，打破體內(nèi)造血因子的平衡，抑制骨髓造血［6］，主要表現(xiàn)為不同程度的造血功能障礙［1，7］，外周血出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞先后明顯下降，易致免疫力降低、感染和出血、衰竭，體重下降，甚至死亡。造血負(fù)性因子的增強(qiáng)是輻射造血損傷的一種促進(jìn)因素［8］。該實(shí)驗(yàn)觀察到單純照射組小鼠照射后4 d、14 d造血調(diào)控因子 G-CSF、TPO、IL-1β和 TNF-α水平均較空白對(duì)照組明顯升高；照射后14 d G-CSF、TPO和IL-1β水平低于照射后4 d，而照射后14 d TNF-α水平高于照射后 4 d，與文獻(xiàn)報(bào)道［6，8］的造血正性調(diào)控因子輻射后先升高后降低、負(fù)性調(diào)控因子持續(xù)升高的規(guī)律的結(jié)果一致。

CFA 化學(xué)名稱 3-（3，4-二羥苯基）-丙烯酸，廣泛存在于西紅柿、草莓、胡蘿卜、咖啡和谷類等多種可食性植物及中草藥如小薊中。文獻(xiàn)表明CFA可以促進(jìn)化療相關(guān)性骨髓抑制的恢復(fù)，提升白細(xì)胞和胸腺指數(shù)，改善毛細(xì)血管通透性，減少感染和出血［9］。CFA還可通過刺激巨核細(xì)胞成熟和刺激粒細(xì)胞增殖、分化、成熟、釋放而提升血小板［10］。CFA具有收縮微血管、提高凝血因子水平、升高白細(xì)胞、血小板及止血的作用，臨床上用于各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥的治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CFA組照射后4 d、14 d小鼠G-CSF、TPO水平明顯高于單純照射組，照射后14 d小鼠G-CSF、TPO和IL-1β水平明顯高于照射后4 d；CFA組照射后4 d、14 d小鼠TNF-α水平明顯低于單純照射組，照射后14 d小鼠TNF-α水平低于照射后4 d，表明CFA對(duì)輻照后小鼠G-CSF、TPO、IL-1β等造血正性調(diào)控因子水平有上調(diào)作用，對(duì)造血負(fù)性調(diào)控因子TNF-α水平有下調(diào)作用。

筆者的早期研究［2］觀察到CFA明顯提高輻射損傷小鼠的白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)，增加CFU-GM、CFU-MK、CFU-S和 SI的數(shù)量，其機(jī)制可能正是CFA對(duì)輻照后小鼠造血調(diào)控因子的影響所致。這為CFA應(yīng)用于輻射防護(hù)與治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有關(guān)CFA對(duì)輻射損傷保護(hù)的最佳劑量、應(yīng)用的最佳時(shí)機(jī)以及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］POVINELLI B，KOKOLUS KM，CURTIN L，et al.The influence of metabolic stress on radiosensitivity of hematopoietic stem and progenitor cells［J］.Blood，2013，122（21）：2447.

［2］杜遵民，賈海鵬，劉靜，等.咖啡酸對(duì)輻射損傷小鼠造血恢復(fù)作用的初步研究［J］. 中國(guó)輻射衛(wèi)生，2015，24（5），449-452.

［3］張之南，郝玉書，趙永強(qiáng)，等.血液病學(xué)［M］.第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：48-57.

［4］楊萌，歐紅玲，邢爽，等.血小板生成素與急性放射?。跩］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2014，41（4）：419-423.

［5］ZELOVA H，HOEK J.TNF-a signalling and inflammation：interactions between old acquaintances［J］.Inflamm Res，2013，62（7）：641-651.

［6］羅慶良，從玉文，郝靜，等.造血因子與急性放射病［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30（3）：186-190.

［7］BROWN KR，RZUCIDLO E.Acute and chronic radiation injury［J］.J Vasc surg，2011，53（1S）：15S-21S.

［8］陳家佩，從玉文，馬平，等.吉林放射事故病人血漿造血活性觀察［J］. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1997，17（1）：26.

［9］祝曉玲，陸陽，李成文，等.咖啡酸對(duì)化療后骨髓抑制合并肺組織急性損傷小鼠毛細(xì)血管通透性及免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（1）：23-25.

［10］ZHANG Q，HU Z，WANG F，et al.Preventive and therapeutical effects of caffeic acid on leucopenia and thrombocytopenia and MPV change induced by cytosine arabinoside in mice［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2008，13（5）：508-511.