IL-35在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系

陳艷玲

(1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌 330006；2、江西省胸科醫(yī)院呼吸二科，南昌 330006)

在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和病死率均位居惡性腫瘤之首，其中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer、NSCLC)的發(fā)生率約占80%以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)世界各地每年因肺癌死亡的人數(shù)在150萬左右[1，2]。盡管NSCLC的治療效果較前有大幅度的提高，但其5年生存率仍未見明顯提高，約在15%左右[3]。當(dāng)前，肺癌的確診主要根據(jù)組織細(xì)胞學(xué)檢查，但是該檢查方法的創(chuàng)傷較大，并且容易發(fā)生并發(fā)癥。血清中腫瘤標(biāo)志物的測定具有取材便捷、檢測方便、易重復(fù)等諸多特點(diǎn)，并且在腫瘤的篩查、診斷、分型及預(yù)后等方面有重要的參考價(jià)值[4]。IL-35(interleukin-35，IL-35)是IL-12家族的最新成員，由EB13及P35亞基組成的異源性二聚體[5]。當(dāng)前，研究者證實(shí)IL-35在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括胃癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌及黑色素瘤[6]。但I(xiàn)L-35與NSCLC相關(guān)性研究相對較少，評價(jià)IL-35在腫瘤患者體內(nèi)的檢測水平及其作用具有重要的臨床意義。本研究運(yùn)用RT-PCR檢測NSCLC患者肺癌組織中IL-35的表達(dá)水平，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA） 分析肺癌患者血清中IL-35的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理因素之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧分析我院2016年7月至2017年9月期間收治的78例經(jīng)手術(shù)、支氣管鏡活檢或者穿刺肺活檢后病理診斷為NSCLC患者的治療情況，其中男 42 例，女 36 例，年齡(45．6±13.7)歲，我們在取樣本前詳細(xì)記錄并核對相關(guān)資料，如患者姓名、性別、年齡、住院號(hào)、聯(lián)系方式、發(fā)病時(shí)間、病理診斷、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤TNM分期、腫瘤是否有淋巴轉(zhuǎn)移、手術(shù)時(shí)間與方式、原發(fā)或復(fù)發(fā)等。根據(jù)患者病理分為肺鱗癌40例及肺腺癌38例，選取手術(shù)治療患者20例，其中肺鱗癌及肺腺癌患者各10例，取得這些患者的癌組織及癌旁組織，并收集手術(shù)7d后患者血清，同時(shí)期來我院體檢健康人群20例作為對照組，本研究均在患者及健康體檢者知情同意后進(jìn)行，并取得了我院倫理委員會(huì)的同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：所納入的患者手術(shù)前均未經(jīng)抗腫瘤治療；所有患者均經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)診斷為非小細(xì)胞肺癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移；伴有其他并發(fā)癥如肺部炎癥、糖尿病等；伴有免疫性疾病患者；伴有血液系統(tǒng)疾病患者；未簽署知情同意者或我院倫理委員會(huì)未同意者；隨訪資料不完善的患者。

1.2 標(biāo)本采集及分組

1.2.1 RT-PCR檢測標(biāo)本 收集20例經(jīng)手術(shù)切除腫塊的NSCLC組織及其癌旁組織來自本院胸外科，癌組織標(biāo)本離體后，選取腫塊組織非壞死部分，癌旁組織取距腫瘤至少2.5cm的肺組織，標(biāo)本均取自術(shù)后1h以內(nèi)，取下后迅速液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清標(biāo)本的收集與保存 NSCLC患者于入院后24h內(nèi)和健康體檢者空腹采用非抗凝真空管采取外周靜脈血5ml，室溫放置60min后，離心機(jī)以6000rpm/min，離心10min，然后取經(jīng)離心后的患者血清放入2ml無菌的EP管中，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?.2.3實(shí)驗(yàn)分組 RT-PCR分組：NSCLC癌組織20例 （肺鱗癌、肺腺癌各10例）與癌旁組織20例；ELISA分組：肺癌組：肺鱗癌組40例、肺腺癌組38例，健康體檢對照組20例；手術(shù)前肺癌組、手術(shù)后肺癌組（該20組患者均為手術(shù)治療的肺癌患者）

1.3方法

1.3.1 檢測方法 ⑴所有患者于術(shù)前清晨空腹抽取外周靜脈血5ml，于6000rpm/min的離心分離機(jī)離心分離10min，置于冰箱保存待檢；⑵采用ELISA法檢測患者血清IL-35水平（嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行相關(guān)操作），記錄分析。

1.3.2 采用Trizol提取法提取20例NSCLC組織和相應(yīng)癌旁肺組織中總RNA后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再應(yīng)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，所有實(shí)驗(yàn)操作步驟都是嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR mix試劑盒使用說明書進(jìn)行操作

qRT-PCR分析基因表達(dá)

EBI3引物P35引物β-actin引物上游下游上游下游上游下游5’-GCTCCCTACGTGCCTCAATGT-3’5’-CCCTGACGCTTGTAACGGAT-3’5’-TCCTCCCTTGAAGAACCGGA-3’5’-TGACAACGGTTTGGAGGGAG-3’5’-CCTGGCATGGAGTCCTGTG-3’5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAC-3’

PCR總反應(yīng)體系為20.0μl，內(nèi)含2xPremix Ex Taq RNA 10.0μl， 上下游引物各 0.4μl，cDNA 2.0μl，其余加雙蒸水補(bǔ)足擴(kuò)增。條件為94℃預(yù)變性2min，94℃ 20s，60℃ 34s， 溫度轉(zhuǎn)換率均為 20℃30s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，70℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，所有樣品均做復(fù)孔，IL-35的相對表達(dá)量用2-ΔΔCT法表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)，(P＜0.05)則表示兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在mRNA水平檢測NSCLC組織中IL-35的表達(dá) 在mRNA水平檢測20例NSCLC癌組織中IL-35表達(dá)水平，IL-35在NSCLC組織中的表達(dá)情況，肺鱗癌中 IL-35 表達(dá)量為（34.22±0.996）ng/ml，肺腺癌中 IL-35 表達(dá)量（32.00±0.906）ng/ml，比正常癌旁組織中的（12.70±0.230）ng/ml顯著增高，并且兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.0001）。在NSCLC中，肺鱗癌組織中IL-35的表達(dá)量高于肺腺癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 IL-35 mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)量

2.2 NSCLC患者血清中IL-35水平比較 通過EILSA對78例NSCLC患者及20健康體檢者血清中IL-35的檢測發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌、肺腺癌、健康體檢者血清中 IL-35 水平分別是 （36.68±3.19）ng/ml、（34.32±3.86）ng/ml和（16.72±4.59）ng/ml，通過對比分析發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者血清中IL-35的水平明顯高于健康體檢者，二者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在肺腺癌與肺鱗癌患者血清中IL-35水平相比，我們發(fā)現(xiàn)鱗癌患者血清中IL-35水平比腺癌患者血清中高，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.514）（見圖2）；通過對20例手術(shù)前后肺癌患者血清中IL-35的檢測發(fā)現(xiàn)手術(shù)前患者血清中IL-35的表達(dá)量明顯高于術(shù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）（見圖 3）

圖2 NSCLC患者血清中IL-35的表達(dá)量

圖3 手術(shù)前后肺癌患者血清中IL-35的表達(dá)量

2.3 NSCLC患者血清中IL-35水平與其病理特性的關(guān)系 通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測78例NSCLC患者血清中IL-35水平變化，分析結(jié)果見表3。我們發(fā)現(xiàn)NSCLS患者血清中IL-35的水平的與患者的年齡、性別及原發(fā)腫瘤的大小之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、TNM 分期之間的有顯著性差異（P＜0.05）。在隨后的分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的分化程度中，IL-35與隨著腫瘤的分化程度成正比；在腫瘤的TNM分期中，腫瘤分期越高，IL-35表達(dá)量越高。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清中IL-35水平較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高。由此，我們可認(rèn)為血清中IL-35的表達(dá)量與NSCLC的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與患者的年齡、性別及原發(fā)腫瘤的大小則沒有相關(guān)性。

3 討論

據(jù)IARC統(tǒng)計(jì)，預(yù)計(jì)到2025年時(shí)，我國每年新增肺癌患者將達(dá)100萬例[7]。當(dāng)前，由于醫(yī)療技術(shù)的不斷的完善，包括最新的靶向藥物治療，但NSCLC患者5年生存率仍然不容樂觀，早發(fā)現(xiàn)、早治療仍是提高患者生存率的主要手段之一，此外，對于肺癌患者及時(shí)有效的治療及預(yù)后的判斷顯得至關(guān)重要，但目前仍無行之有效的生物學(xué)指標(biāo)。

2007年，國外學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)一種由CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的額新型抑炎性細(xì)胞因子，并將其命名為白介素35(interleukin-35，IL-35)[8]。IL-35通過表達(dá)于細(xì)胞上受體IL-35R發(fā)揮作用。在結(jié)直腸癌中，高表達(dá)IL-35可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤生長，同時(shí)還檢測了肺癌、結(jié)直腸癌及肝癌等多種腫瘤細(xì)胞系中IL-35的表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)IL-35的兩個(gè)亞基P35及EB13共表達(dá)，當(dāng)給予外源性的IFN-γ及TNF-α刺激后，腫瘤細(xì)胞表達(dá)IL-35的量增加[9]。在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)IL-35的表達(dá)后，cyclinB、cyclin D及cdk4的表達(dá)隨之增加，同時(shí)下調(diào)p27的表達(dá)，促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌病程的進(jìn)展[10]。通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)IL-35的腫瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IL-35導(dǎo)致腫瘤停滯在細(xì)胞G1期，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可以引起Fas基因的表達(dá)上調(diào)及Cyclin D1、Survivin及Bcl-2基因表達(dá)水平的下調(diào)[11]。但是，也有不同的研究結(jié)果，在乳腺癌的的研究中，IL-35被認(rèn)為具有抑制腫瘤的特性[12]。

表1 外周血IL－35表達(dá)與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系

在本研究中，我們通過檢測NSCLC患者中血漿及癌組織中IL-35的表達(dá)量，并分析血清中IL-35與患者臨床病理特征之間的聯(lián)系。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：第一，NSCLC患者癌組織及血漿中IL-35的表達(dá)量明顯高于癌旁及健康體檢者，在癌組織中的IL-35的表達(dá)量與肺癌的組織類型顯著相關(guān)，肺鱗癌中IL-35高于肺腺癌，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是在血清中的檢測結(jié)果顯示，他們之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分析其結(jié)果，可考慮為統(tǒng)計(jì)樣本導(dǎo)致，亦或是由于檢測方法的不同導(dǎo)致；第二，IL-35的表達(dá)量與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM密切相關(guān)，腫瘤的分化程度中，IL-35與腫瘤的分化程度成正比；在腫瘤的TNM分期中，腫瘤分期越高，IL-35表達(dá)量越高。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清中IL-35水平較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高。該結(jié)果與Gu等[13]研究結(jié)果較為一致，他們認(rèn)為IL-35與NSCLC疾病的進(jìn)程及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但在本研究中發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的血清中IL-35的表達(dá)量與分化程度密切相關(guān)，這與Gu研究結(jié)果不符，考慮為在研究過程中由于樣本量的差異導(dǎo)致，故如需獲得更加嚴(yán)謹(jǐn)及準(zhǔn)確的結(jié)果，仍需更大樣本、從多方位來驗(yàn)證本結(jié)果。

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