枯草芽孢桿菌對多浪羊消化率、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及血液指標(biāo)的影響

蘇勇華，方 雷，應(yīng) 璐，李雅婷，蔣 慧

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

多浪羊是新疆南疆養(yǎng)殖數(shù)量較多的優(yōu)良地方品種，具有飼料報酬高、產(chǎn)肉率高、肉質(zhì)細(xì)嫩和肉膽固醇含量低等特征［1］，其羊奶乳蛋白含量（5.79%）、乳脂肪含量（6.4%）、乳糖含量（4.56%）遠(yuǎn)高于牛奶和人奶［2］，主要分布于喀什地區(qū)、阿克蘇地區(qū)和巴州地區(qū)，其品種具有抗寒、抗病、耐粗飼、多胎性好、雙羔率高等特性［3］，所以優(yōu)化養(yǎng)殖多浪羊?qū)π陆竽翗I(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

微生物飼料添加劑（micro－ecological feed additives）是指可直接飼喂給動物，通過調(diào)控動物腸道微生態(tài)平衡從而達(dá)到預(yù)防疾病、促進(jìn)動物生長和提高飼料利用率等作用的一類活性微生物或其培養(yǎng)物。我國農(nóng)業(yè)部2008年12月公布的1126號公告《飼料添加劑品種目錄（2008）》中規(guī)定可直接飼喂的飼用微生物添加劑菌種共16種，其中包括枯草芽孢桿菌、嗜乳酸桿菌、干酪乳桿菌等。芽孢桿菌制劑具有耐鹽、耐高溫、抗干燥等優(yōu)點(diǎn)［4］，而枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）作為芽孢桿菌的一種，具有拮抗致病微生物、增強(qiáng)動物免疫功能，同時能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，可有效分解復(fù)雜碳水化合物，促進(jìn)動物對飼料養(yǎng)分的消化代謝［5－6］，因而在動物飼糧中使用枯草芽孢桿菌類微生物添加劑具有防治疾病、促進(jìn)生長等作用［7］。

現(xiàn)階段對枯草芽孢桿菌的研究主要集中在單胃動物及水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，鮮見關(guān)于枯草芽孢桿菌對多浪羊影響的研究［8－11］。本試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌是由疏葉駱駝刺青貯飼料中分離鑒定得到的，該菌是否適合作為微生物飼料添加劑，是否存在差異性及安全問題，有待進(jìn)一步研究，本試驗(yàn)通過在多浪羊日糧中添加不同劑量的枯草芽孢桿菌，研究其對多浪羊表觀消化率、平均日增質(zhì)量、發(fā)酵參數(shù)及血液指標(biāo)的影響，旨在為枯草芽孢桿菌在多浪羊飼料中的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌，從疏葉駱駝刺青貯飼料中分離鑒定得到，保存于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

選取同年齡、同性別、健康體況相近的多浪羊12只，飼喂于塔里木大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)站，試驗(yàn)前對試驗(yàn)羊打耳標(biāo)、藥浴、喂驅(qū)蟲藥，對羊舍、料槽、水槽等進(jìn)行消毒。同組同槽飼養(yǎng)，在每天08：30和18：30定時飼喂，并自由飲水?？莶菅挎邨U菌每天早上隨玉米粉一同混合飼喂給試驗(yàn)羊，并注意觀察羊的健康狀況。試驗(yàn)期為30 d，其中預(yù)試期10 d，正試期20 d。飼喂自配日糧，其基礎(chǔ)日糧配方見表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)羊隨機(jī)分為4個處理，每個處理3只羊。試驗(yàn)采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，Ⅰ組為對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組為試驗(yàn)組，在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，分別添加活菌數(shù)為3.2×109、3.2×1010、3.2×1011CFU／g的枯草芽孢桿菌。

表1 試驗(yàn)羊日糧組成

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 日增質(zhì)量及消化率測定 在試驗(yàn)的第1天和第28、29、30天晨飼前對多浪羊進(jìn)行空腹稱體質(zhì)量，計(jì)算平均日增質(zhì)量。在正試期每天09：30和19：30分別收集糞袋中的鮮糞并稱質(zhì)量，每天收集的鮮糞樣按每100 g糞樣加5 mL 10%硫酸進(jìn)行固氮，同時隨機(jī)收集飼喂的飼料原料樣本，連續(xù)收集4 d，將所有糞樣和料樣分別混勻，按照四分法進(jìn)行取樣，65℃烘干48 h后裝于樣品袋中備用。參照張麗英編寫的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》測定糞樣及料樣中的DM、CP、NDF、ADF值［12］，按王鈺明等的方法［13］測定糞樣和料樣中的酸不溶灰分（AIA）以計(jì)算 DM、CP、NDF、ADF的表觀消化率。

1.4.2 多浪羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定 在第30天晨飼前對多浪羊進(jìn)行空腹采取瘤胃液，將采集的瘤胃液置于50 mL離心管中，用于乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量、pH值和NH3－N濃度等瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定，其中VFA采用氣相色譜法測定［14］，pH值用雷磁 PHSJ－5酸度進(jìn)行測定，NH3－N濃度用比色法進(jìn)行測定［15］。

1.4.3 多浪羊血液指標(biāo) 在第30天晨飼前對多浪羊進(jìn)行空腹頸靜脈采血，分別收集于抗凝管和非抗凝管中，其中抗凝管中的血用于測定血常規(guī)指標(biāo)，非抗凝管中的血用于制備血清，用于測定膽固醇、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白等生化指標(biāo)。所有的生化指標(biāo)測定均在BECKMAN COULTER AU480型全自動生化分析儀上進(jìn)行，當(dāng)天完成測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步整理，采用分析軟件DPS作方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多浪羊平均日增質(zhì)量及消化率

由表2可知，多浪羊平均日增質(zhì)量和CP消化率均是試驗(yàn)組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）顯著高于對照組（P＜0.05），而3個試驗(yàn)組之間差異不顯著；干物質(zhì)消化率表現(xiàn)為試驗(yàn)組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）顯著高于對照組（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅱ組與Ⅲ組差異顯著（P＜005），但與Ⅳ組差異不顯著；NDF和ADF消化率均是試驗(yàn)組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）顯著高于對照組（P＜0.05），但試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著。

表2 多浪羊平均日增質(zhì)量及消化率

2.2 多浪羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表3可知，多浪羊瘤胃液的NH3－N濃度表現(xiàn)為Ⅱ、Ⅳ組均顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組（P＜0.05），Ⅱ組與Ⅳ組、Ⅰ組與Ⅲ組差異不顯著；而瘤胃液的pH值、總揮發(fā)性脂肪酸含量、丙酸含量和丁酸含量在4個處理間差異均不顯著；瘤胃液乙酸含量表現(xiàn)為Ⅱ組顯著低于其他3組（P＜0.05），Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組之間差異不顯著；在4個處理中，瘤胃液均未檢出戊酸。

2.3 多浪羊血液指標(biāo)

表3 多浪羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)

2.3.1 多浪羊血常規(guī)指標(biāo) 由表4可知，多浪羊的白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞百分比均表現(xiàn)為Ⅳ組均顯著高于其他3組（P＜0.05），而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組差異不顯著；Ⅲ、Ⅳ組的紅細(xì)胞數(shù)量均分別顯著高于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），Ⅲ組與Ⅳ組、Ⅰ組與Ⅱ組差異不顯著；血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、大型血小板比例和血小板平均體積在4組間均無顯著差異；紅細(xì)胞平均體積和平均血紅蛋白含量均是對照Ⅰ組最高；試驗(yàn)Ⅳ組平均血紅蛋白濃度顯著高于其他3組（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間差異不顯著；血小板平均分布寬度在對照Ⅰ組與3個試驗(yàn)組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）間差異不顯著，而試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間存在顯著差異（P＜0.05）。

2.3.2 多浪羊血清生化指標(biāo) 由表5可知，血液總膽紅素含量除Ⅰ組與Ⅱ組之間差異不顯著外，其余各組間的TB含量差異顯著（P＜0.05）；間接膽紅素含量和直接膽紅素含量在4個組之間均無顯著差異。血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶活性、堿性磷酸酶活性、尿素和肌酐含量在4個組之間也無明顯差異。Ⅱ組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于Ⅳ組（P＜005），其他3組之間差異均不顯著。

Ⅰ組總蛋白含量與Ⅱ組相比差異不顯著，但顯著高于Ⅲ、Ⅳ組（P＜0.05），且Ⅲ、Ⅳ組間的總蛋白含量差異也不顯著；血液白蛋白含量除Ⅳ組顯著低于Ⅱ和Ⅲ組（P＜0.05）外，其余3組間差異均不顯著；血液球蛋白含量除Ⅰ組與Ⅱ組差異不顯著外，其余各組間均差異顯著（P＜0.05）；血液白球比除Ⅰ組與Ⅳ組差異不顯著外，其余各組間差異均顯著（P＜005）。

表4 多浪羊血常規(guī)指標(biāo)

表5 多浪羊血液生化指標(biāo)

3 討論

3.1 添加枯草芽孢桿菌對多浪羊日增質(zhì)量及養(yǎng)分消化率的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加枯草芽孢桿菌后顯著提高了多浪羊平均日增質(zhì)量及干物質(zhì)消化率，表明枯草芽孢桿菌具有促進(jìn)飼料消化的功效。添加枯草芽孢桿菌使NDF、ADF的消化率均有不同程度提高，與鄧露芳等利用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的納豆芽孢桿菌提高瘤胃糖類的消化代謝［16］得出相似的結(jié)論。出現(xiàn)這樣的結(jié)果，可能與枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的酶有關(guān)，如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，它們能有效降解復(fù)雜的碳水化合物［6］，動物飼喂枯草芽孢桿菌后，可能不同程度地提高動物腸道中蛋自酶、淀粉酶等的活性，從而提高飼料消化利用率。

3.2 添加枯草芽孢桿菌對多浪羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加枯草芽孢桿菌后pH值無明顯變化，但在一定程度上有降低的趨勢，原因可能是枯草芽孢桿菌促進(jìn)了糖類的消化代謝，提高了瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸的含量。瘤胃氨態(tài)氮濃度是反映瘤胃氮代謝的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中，除Ⅲ組（3.2×1010CFU／g）與對照組（Ⅰ）差異不顯著外，其余2組能顯著提高瘤胃氨態(tài)氮濃度，與鄧露芳等報道的納豆枯草芽孢桿菌能顯著提高瘤胃NH3－N濃度有相似的結(jié)果［16］。也有研究認(rèn)為枯草芽孢桿菌促進(jìn)了瘤胃原蟲的生長，瘤胃原蟲對細(xì)菌的吞食作用可降低瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成量，使NH3－N濃度升高［17］。除Ⅱ組乙酸含量和Ⅱ、Ⅲ組乙酸／丙酸低于對照組外，其他揮發(fā)性脂肪酸指標(biāo)均不存在顯著差異，表明添加枯草芽孢桿菌不能改變瘤胃發(fā)酵類型，不影響飼料的利用。

3.3 添加枯草芽孢桿菌對多浪羊血液指標(biāo)的影響

3.3.1 添加枯草芽孢桿菌對多浪羊血常規(guī)指標(biāo)影響 血常規(guī)是反映動物機(jī)體狀況的重要指標(biāo)，血液對維持動物機(jī)體的正常生命活動具有極其重要的意義，血液各種成分的定量分析能比較客觀地反映動物機(jī)體的生理機(jī)能及代謝狀況［18］，也是疾病診斷和監(jiān)測的重要參考指標(biāo)。白細(xì)胞是動物機(jī)體的防御細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)更新的速度比較快，參與機(jī)體對細(xì)菌、病毒等異物入侵時的免疫過程，白細(xì)胞數(shù)量的變化是機(jī)體免疫力變化的標(biāo)志，白細(xì)胞數(shù)量的多少可反映機(jī)體免疫狀況。飼喂枯草芽孢桿菌的多浪羊血液中白細(xì)胞數(shù)除Ⅳ組增高外，其他2組與對照無明顯差異，說明飼料添加枯草芽孢桿菌對多浪羊免疫力無破壞意義。紅細(xì)胞是血液有形部分最主要的成分，主要功能是攜帶和運(yùn)輸氧氣，以滿足機(jī)體生理活動和運(yùn)動的需要，血紅蛋白是血液中承擔(dān)運(yùn)輸氧氣的直接載體［19］。紅細(xì)胞和血紅蛋白共同反映動物機(jī)體的運(yùn)動能力、呼吸及營養(yǎng)狀況、環(huán)境適應(yīng)能力。本試驗(yàn)飼喂枯草芽孢桿菌的多浪羊血液中紅細(xì)胞數(shù)略高于對照組，其中Ⅲ、Ⅳ組與對照組差異達(dá)到了顯著水平；血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積不存在明顯差異。表明飼喂枯草芽孢桿菌不影響其運(yùn)輸氧氣的能量。

3.3.2 添加枯草芽孢桿菌對多浪羊血清生化指標(biāo)的影響膽紅素（bilirubin）是臨床上判定黃疸的重要依據(jù)，也是肝功能檢測的重要指標(biāo)。膽紅素主要在肝臟代謝，包括肝細(xì)胞對血液內(nèi)膽紅素的攝取、膽紅素在肝細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)載、未結(jié)合膽紅素［（unconjugated bilirubin，UCB）又稱游離膽紅素］轉(zhuǎn)化為結(jié)合膽紅素（conjugated bilirubin，CB）、CB膽汁排泄等一系列緊密銜接且相互影響的生理過程［20］。作為人體一種重要的內(nèi)源性物質(zhì)，膽紅素生理濃度具有抗氧化活性，高濃度易產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆損傷［21］。本試驗(yàn)中，飼喂枯草芽孢桿菌多浪羊的血液中總膽紅素含量表現(xiàn)為增長趨勢（Ⅱ組與對照組無顯著差異），但仍處于正常值范圍內(nèi)，同時直接膽紅素和間接膽紅素含量變化均不存在顯著差異，表明飼料中添加高劑量的枯草芽孢桿菌可能會對羊的肝臟產(chǎn)生一定的毒害作用，生產(chǎn)中應(yīng)控制用量。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶在蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用，同時關(guān)聯(lián)著三羧酸循環(huán)中草酰乙酸和酮戊二酸，是聯(lián)系蛋白質(zhì)代謝和糖代謝的重要氨基轉(zhuǎn)移酶。正常情況下，這2種酶在動物的肝臟和心肌細(xì)胞中含量最高，血清中這2種酶活性較低。當(dāng)組織細(xì)胞受損或通透性增大時，大量的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液，使血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增高，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性是肝細(xì)胞受損最靈敏的指標(biāo)之一［22］。添加枯草芽孢桿菌后谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量與對照組差異不顯著，其中Ⅳ組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性明顯低于對照組，說明枯草芽孢桿菌對多浪羊心臟無毒害作用，甚至可以保護(hù)心臟。

谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶能使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，改善蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性、乳化性、流變性等多種性質(zhì)，從而改變食品及其他產(chǎn)品的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而賦予產(chǎn)品特有的結(jié)構(gòu)特性和黏合性能［23］。堿性磷酸酶是一種通過寡糖磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上的結(jié)合蛋白，在生物體可直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝的生理過程，且參與體內(nèi)的鈣、磷代謝，維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例［24］。有研究表明，堿性磷酸酶活性降低能使組織細(xì)胞生理活動維持于較低的水平以適應(yīng)饑餓脅迫［25］。也有研究表明，堿性磷酸酶活性的高低也反映肝臟的功能狀態(tài)，它的活性降低可有效保護(hù)肝臟免受損傷［26］。飼喂枯草芽孢桿菌多浪羊血清谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶與對照組不存在顯著差異，并夠降低堿性磷酸酶含量，說明飼喂枯草芽孢桿菌對多浪羊的肝臟、腎臟和心臟無不良影響，對多浪羊的營養(yǎng)狀況和羊肉品質(zhì)也無不良影響。

血液中的尿素，是機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)中氮代謝的最終主要產(chǎn)物，不與血漿蛋白結(jié)合。血尿素的濃度取決于機(jī)體氮分解代謝能力和腎臟的排泄能力。血液中的肌酐，一般是內(nèi)生血肌酐，內(nèi)生肌酐是體內(nèi)肌肉代謝的產(chǎn)物。在肌肉中，肌酸主要通過不可逆的非酶脫水反應(yīng)緩緩地形成肌酐，再釋放到血液中，隨尿排泄。肌酐濃度反映腎臟損害、腎小球?yàn)V過率、尿路通暢性等功能，是一項(xiàng)比尿素、尿酸更特異的腎功能指標(biāo)，肌酐濃度升高表明腎功能受損［19］。本試驗(yàn)中，飼喂枯草芽孢桿菌多浪羊血液中的尿素、肌酐含量并無顯著變化，說明飼料中添加枯草芽孢桿菌對機(jī)體氮分解代謝能力和腎臟功能無顯著影響。

蛋白質(zhì)是生命活動中其他營養(yǎng)物質(zhì)所不能代替的，在機(jī)體的建造和營養(yǎng)方面具有重要意義，血清中總蛋白主要由白蛋白和球蛋白組成，其指標(biāo)可反映機(jī)體蛋白質(zhì)吸收與代謝狀況［19］，一般來說，機(jī)體營養(yǎng)狀況好，蛋白質(zhì)合成增加，血清總蛋白濃度升高；同時，白蛋白和球蛋白也是評價肝臟功能的重要指標(biāo)。添加枯草芽孢桿菌后，Ⅲ、Ⅳ組的總蛋白和球蛋白含量低于對照組；Ⅳ組的白蛋白含量低于Ⅱ、Ⅲ組，各處理與對照比差異不顯著，表明低劑量的Ⅱ組（3.2×109CFU／g）對多浪羊機(jī)體吸收、代謝及免疫過程無顯著影響。

4 結(jié)論

飼料中添加3種劑量的枯草芽孢桿菌均能提高多浪羊的平均日增質(zhì)量、DM、CP、NDF和ADF的表觀消化率，但對多浪羊瘤胃 pH值、TVFA、丙酸、丁酸含量無顯著影響。添加3.2×109和 3.2×1011CFU／g枯草芽孢桿菌組的瘤胃NH3－N含量都有所提高。Ⅱ組（添加3.2×109CFU／g枯草芽孢桿菌組）的血常規(guī)（平均血蛋白含量除外）和血液生化指標(biāo)（白球比除外）與對照組無顯著差異，因此在本試驗(yàn)中效果最好。

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