基于線粒體COI基因序列進(jìn)行庫蠓二囊亞屬近似種的分子鑒定

，，，，

蠓科(Ceratopogonidae)隸屬于雙翅目、長角亞目，是一類體型微小、種類繁多、分布甚廣的昆蟲，其中部分種類刺吸、叮咬人畜，稱吸血蠓。庫蠓(CulicoidesLatreille, 1809)是吸血蠓中分布最廣、種類最多、與人畜關(guān)系最密切的屬，體長一般1～3 mm，全世界有1 368種、我國有347種[1-2]。庫蠓刺吸人、禽、畜等血液，不僅帶來直接叮咬騷擾，而且是藍(lán)舌病(BT)、乙型腦炎(JV)、絲蟲病等多種疾病病原體的傳播媒介[2-3]。因此，準(zhǔn)確鑒定疾病媒介對(duì)蠓傳疾病的監(jiān)測、防治具有重要的意義。

庫蠓屬昆蟲體型微小、形態(tài)學(xué)鑒定特征稀少(如翅斑形態(tài)、嗅覺器分布、感覺器有無等特征)，近似種類容易混淆，且要求鑒定人員具有極高的專業(yè)能力。例如林島庫蠓C.gaponus和無害庫蠓C.innoxius，其外部形態(tài)特征極其相似，僅有翅徑端淡斑延伸至中1脈有區(qū)別。另外，用酒精保存蠓標(biāo)本時(shí)翅上的斑紋很容易褪色，這必定會(huì)影響種類鑒定的準(zhǔn)確性。因此，在蠓科昆蟲分類研究中亟需能對(duì)近似種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的方法。

目前，以DNA序列分析為依據(jù)的分子鑒定已成為物種鑒定的常用技術(shù)手段，極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定的缺陷。然而，蠓科昆蟲的分子分類研究起步較遲，自1992年研究變翅庫蠓(Culicoidesvariipennis)種群的基因差異開始[4]，國外的蠓科分子生物學(xué)研究有了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，相比之下國內(nèi)卻鮮有報(bào)道。因此，本研究以庫蠓屬二囊亞屬中近似的8個(gè)種類(林島庫蠓C.gaponus、標(biāo)翅庫蠓C.insignipennis、無害庫蠓C.innoxius、連斑庫蠓C.jacobsoni、南山庫蠓C.lansangensis、新竹庫蠓C.liui、長喙庫蠓C.longirostris、異域庫蠓C.peregrinus)為例，利用線粒體COI基因進(jìn)行分子鑒定，以期更準(zhǔn)確地鑒別不同地理種群庫蠓近似種，從而為吸血蠓DNA分類研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蠓標(biāo)本 研究中所用的9種、15個(gè)地理種群的32只庫蠓標(biāo)本，除無害庫蠓C.innoxius是來自GenBank數(shù)據(jù)庫外，其余8種均采自云南、貴州、四川、重慶、廣西、海南等省份，詳見表1。

1.1.2試劑 基因組提取試劑盒(QIAGEN, 德國)、PCR MasterMix(TIANGEN, 中國)、引物(上海捷瑞生物工程有限公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN, 中國)、瓊脂糖(Biowest Agarose, 西班牙)等。

1.1.3儀器設(shè)備 光學(xué)體式顯微鏡(德國Leica公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國BOI-RAD公司)、UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國BOI-RAD公司)等。

表1 供試庫蠓的相關(guān)信息

Tab.1 Information of the biting midges in this study

標(biāo)本號(hào)種名雌雄采集地CQ-1荒川庫蠓C.arakawai雄蟲重慶北碚區(qū)CQ-2長喙庫蠓C.longirostris雌蟲重慶開州區(qū)CQ-3長喙庫蠓C.longirostris雌蟲重慶開州區(qū)GX-1荒川庫蠓C.arakawai雌蟲廣西大瑤山自然保護(hù)區(qū)GX-2荒川庫蠓C.arakawai雄蟲廣西大瑤山自然保護(hù)區(qū)GZ-1荒川庫蠓C.arakawai雌蟲貴州遵義市GZ-2荒川庫蠓C.arakawai雄蟲貴州遵義市GZ-3連斑庫蠓C.jacobsoni雌蟲貴州望謨縣GZ-4南山庫蠓C.lansangensis雌蟲貴州望謨縣GZ-5南山庫蠓C.lansangensis雌蟲貴州銅仁市GZ-6南山庫蠓C.lansangensis雌蟲貴州榕江縣HN-1林島庫蠓C.gaponus雌蟲海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)HN-2連斑庫蠓C.jacobsoni雌蟲海南霸王嶺自然保護(hù)區(qū)HN-3連斑庫蠓C.jacobsoni雌蟲海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)HN-4連斑庫蠓C.jacobsoni雌蟲海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)HN-5南山庫蠓C.lansangensis雌蟲海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)HN-6南山庫蠓C.lansangensis雌蟲海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)HN-7新竹庫蠓C.liui雌蟲海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)SC-1荒川庫蠓C.arakawai雌蟲四川瀘州市SC-2荒川庫蠓C.arakawai雄蟲四川瀘州市SC-3長喙庫蠓C.longirostris雌蟲四川雅安市YN-1標(biāo)翅庫蠓C.insignipennis雌蟲云南江城縣YN-2連斑庫蠓C.jacobsoni雌蟲云南勐臘縣YN-3南山庫蠓C.lansangensis雌蟲云南景洪市YN-4南山庫蠓C.lansangensis雌蟲云南江城縣YN-5南山庫蠓C.lansangensis雌蟲云南勐臘縣YN-6新竹庫蠓C.liui雌蟲云南江城縣YN-7新竹庫蠓C.liui雌蟲云南勐臘縣YN-8異域庫蠓C.peregrinus雌蟲云南江城縣KJ909533無害庫蠓C.innoxius雄蟲印度KT307825無害庫蠓C.innoxius雌蟲印度KF145176無害庫蠓C.innoxius雌蟲印度

1.2 方法

1.2.1蠓采集 根據(jù)蠓的生活習(xí)性，選擇網(wǎng)掃法和燈誘法在不同的生態(tài)環(huán)境(稻田、洼地、樹林、牲畜廄舍、人群聚居地等)布置采樣點(diǎn)進(jìn)行蠓收集，并將其保存于無水乙醇中。

1.2.2標(biāo)本鑒定 按照常規(guī)方法對(duì)蠓標(biāo)本進(jìn)行分選、解剖，除胸部外制成永久裝片用于形態(tài)鑒定，胸部樣本單獨(dú)編號(hào)后進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)。

待研究庫蠓根據(jù)外部形態(tài)特征按照文獻(xiàn)用顯微鏡鏡檢鑒定種類，并進(jìn)行一側(cè)翅的拍照(圖1)。

1：林島庫蠓C. gaponus；2：異域庫蠓C. peregrinus；3：標(biāo)翅庫蠓C. insignipennis；4：無害庫蠓C. innoxius；5：連斑庫蠓C. jacobsoni；6：南山庫蠓C. lansangensis；7：新竹庫蠓C. liui；8：長喙庫蠓C. longirostris圖1 庫蠓近似種一側(cè)翅圖Fig.1 Wing of one side of sibling species

1.2.3基因組DNA提取 將保存的庫蠓胸部研磨后，按照QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit說明書進(jìn)行單只庫蠓基因組DNA提取，并保存至-20 ℃。

1.2.4PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物包括上游引物L(fēng)CO1490(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAA-AAATCA-3′)和下游引物HCO2198(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件如下：DNA模板1.5 μL,上游引物(10 μmol/L) 1 μL,下游引物(10 μmol/L) 1 μL,2×PCR MasterMix 12.5 μL,ddH2O 9 μL,總體系25 μL,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 5 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.5PCR產(chǎn)物鑒定與回收 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶判斷是否為目的條帶。按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物切膠純化，純化后的產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.6COI序列分析 利用Clustal X、DNA MAN、MEGA 6.0等生物信息學(xué)軟件對(duì)庫蠓線粒體DNA COI序列進(jìn)行比對(duì)、編輯、比較等分析，以Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離矩陣。以荒川庫蠓(C.arakawai)為外群，通過鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并通過Bootstrap 1000次自舉檢驗(yàn)系統(tǒng)樹中各結(jié)點(diǎn)的置信值。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增及序列測定 本研究通過對(duì)8種、13個(gè)地理種群的29只庫蠓線粒體COI基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和雙向測序，并經(jīng)過序列比對(duì)及人工校對(duì)后，最終獲得長度約650 bp的COI基因片段。

2.2序列比對(duì) 將不同種類庫蠓的全部COI序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的同源序列進(jìn)行比對(duì)，在數(shù)據(jù)庫中搜索到荒川庫蠓C.arakawai(登錄號(hào)分別為KF528696、GU070920、KF528696、AB360975)、連斑庫蠓C.jacobsoni(登錄號(hào)分別為KT352455、KT297817)和異域庫蠓(C.peregrinus)(登錄號(hào)為KT307853)的同源序列，序列相似度皆大于99%，數(shù)據(jù)顯示這3種庫蠓的形態(tài)鑒定結(jié)果與COI基因序列比對(duì)結(jié)果一致，表明COI序列可用于庫蠓種類鑒別。

2.3遺傳距離 利用MEGA 6.0軟件計(jì)算庫蠓COI序列的遺傳距離(表2)，其中無害庫蠓(C. innoxius)的COI序列來自GenBank(登錄號(hào)分別為KJ909533、KT307825、KF145176)。結(jié)果表明，種內(nèi)和種間遺傳距離分別為0.000～0.019和0.214～0.302，兩者差異顯著(表3)。因此，通過COI序列遺傳距離分析可以區(qū)分庫蠓不同種類，即適用于種及以下水平的種類鑒別。

表2 庫蠓線粒體COI序列的遺傳距離矩陣

Tab.2 Genetic distance matrix of biting midges mitochondrial COI sequence

NO.12345678910111213141516171819202122232425262728293031120.28030.1540.28040.1710.2900.01950.1540.2850.0030.01560.2570.2800.2320.2480.23670.2650.2920.2390.2550.2430.01980.2570.2870.2340.2500.2390.0120.00790.2570.2870.2340.2500.2390.0120.0070.000100.2570.2870.2340.2500.2390.0120.0070.0000.000110.1920.2900.1790.1920.1840.2580.2700.2600.2600.260120.1920.2920.1790.1920.1840.2600.2720.2630.2630.2630.005130.1900.2900.1770.1900.1820.2580.2700.2600.2600.2600.0070.002140.1950.2920.1770.1900.1820.2580.2700.2600.2600.2600.0030.0050.007150.1920.2900.1790.1920.1840.2600.2720.2630.2630.2630.0020.0030.0050.002160.1920.2900.1790.1920.1840.2600.2720.2630.2630.2630.0020.0030.0050.0020.000170.1950.2950.1820.1950.1860.2630.2750.2650.2650.2650.0070.0020.0030.0070.0050.005180.1920.2970.1790.1920.1840.2580.2700.2600.2600.2600.0080.0030.0050.0080.0070.0070.005190.2200.3020.1840.1940.1880.2670.2690.2650.2650.2650.2050.2080.2050.2100.2080.2080.2100.208200.2150.3020.1790.1900.1840.2650.2670.2620.2620.2620.2010.2030.2010.2050.2030.2030.2050.2030.003210.2150.3020.1790.1900.1840.2650.2670.2620.2620.2620.2010.2030.2010.2050.2030.2030.2050.2030.0030.000220.2650.2120.2390.2500.2430.1880.1880.1810.1810.1810.2650.2680.2650.2650.2680.2680.2700.2650.2550.2550.255230.2600.2170.2340.2460.2390.1850.1860.1790.1790.1790.2600.2630.2600.2600.2630.2630.2650.2600.2550.2550.2550.005240.2620.2140.2360.2480.2410.1900.1900.1830.1830.1830.2630.2650.2630.2630.2650.2650.2680.2630.2580.2580.2580.0020.003250.2670.2240.2070.2180.2110.2530.2500.2500.2500.2500.2700.2700.2720.2670.2700.2700.2720.2700.2820.2770.2770.2030.1960.201260.2810.2330.2370.2390.2370.2490.2520.2450.2450.2450.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2120.2160.2140.216270.2810.2330.2390.2410.2390.2490.2520.2450.2450.2450.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2140.2190.2160.2190.002280.2810.2330.2370.2390.2370.2490.2520.2450.2450.2450.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2120.2160.2140.2160.0000.002290.2840.2350.2390.2410.2390.2520.2540.2470.2470.2470.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2140.2190.2160.2190.0020.0030.002300.2810.2330.2370.2390.2370.2490.2520.2450.2450.2450.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2120.2160.2140.2160.0000.0020.0000.002310.2810.2330.2370.2390.2370.2490.2520.2450.2450.2450.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2120.2160.2140.2160.0000.0020.0000.0020.000320.2810.2330.2370.2390.2370.2490.2520.2450.2450.2450.2830.2850.2830.2880.2850.2850.2880.2850.2910.2890.2890.2120.2160.2140.2160.0000.0020.0000.0020.0000.000

1：林島庫蠓C.gaponus(HN-1)；2：標(biāo)翅庫蠓C.insignipennis(YN-1)；3-5：無害庫蠓C.innoxius(KJ909533.2/KF145176.1/KT307825.1)；6-10：連斑庫蠓C.jacobsoni(YN-2/GZ-3/HN-2/HN-3/HN-4)；11-18：南山庫蠓C.lansangensis(YN-3/GZ-4/GZ-5/YN-4/HN-5/HN-6/YN-5/GZ-6)；19-21：新竹庫蠓C.liui(HN-7/YN-6/YN-7)；22-24：長喙庫蠓C.longirostris(SC-3/CQ-2/CQ-3)；25：異域庫蠓C.peregrinus(YN-8)；26-32：荒川庫蠓C.arakawai(CQ-1/GX-1/GX-2/GZ-1/GZ-2/SC-1/SC-2)

表3 不同階元庫蠓線粒體COI序列遺傳距離分析

Tab.3 Genetic distance analysis of different taxonomic levels Culicoides about the mitochondrial COI sequence

組別遺傳距離(x±s)種內(nèi)組0.006±0.007a種間組0.543±0.09a

注：與種內(nèi)遺傳距離相比，t=119.452,aP<0.05

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析 以荒川庫蠓C.arakawai為外群，采用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)分別構(gòu)建9種庫蠓的系統(tǒng)發(fā)育樹，得到基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析表明：

①不同種類各自構(gòu)成單系(群)，同一種類不同地理種群各自聚為一支(如南山庫蠓C.lansangensis、新竹庫蠓C.liui、無害庫蠓C.innoxius、林島庫蠓C.gaponus、連斑庫蠓C.jacobsoni、長喙庫蠓C.longirostris、異域庫蠓C.peregrinus、標(biāo)翅庫蠓C.insignipennis、荒川庫蠓C.arakawai)，不同庫蠓種類間無交叉，該結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

②種類的親緣關(guān)系明顯，如無害庫蠓C.innoxius與林島庫蠓C.gaponus首先聚在一起，親緣關(guān)系最近并構(gòu)成姐妹群，這與形態(tài)鑒定結(jié)果相一致。上述兩近似種的形態(tài)特征十分相近(表4)，其中翅斑分布除徑端淡斑外幾乎無異(圖2)。

圖2 基于線粒體COI序列構(gòu)建的NJ樹Fig.2 Neighbour-Joining tree constructed based on mitochondrial COI sequence

表4 林島庫蠓C. gaponus與無害庫蠓C. innoxius形態(tài)特征對(duì)比

Tab.4 Comparison of morphological features of C. gaponus and C. innoxius

種名接眼式小眼面間柔毛感覺器窩翅徑端淡斑延伸至中1脈翅臀室淡斑數(shù)目翅中4室基部前緣有淡色帶翅徑5室淡斑鄰接端緣翅中1室淡斑和中2室淡斑連接受精囊形態(tài)林島庫蠓C.gaponus是無有是2是否是橢圓形無害庫蠓C.innoxius是無有否2是否是近球形

3 討 論

線粒體DNA(mtDNA)具多拷貝、分子量小、母系遺傳、突變速度快等特點(diǎn)[5]，能準(zhǔn)確鑒別物種。COI是線粒體上約650 bp的DNA片段，結(jié)構(gòu)較保守，具有較多系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，適用于解析親緣關(guān)系密切的生物類群[6-8]。目前，COI基因已應(yīng)用于蠓分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，且已有研究表明利用COI基因進(jìn)行種類鑒定可鑒別95%的已知庫蠓[9]。另外，COI基因很大程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)在鑒定蛹、幼蟲及肢體殘缺形態(tài)的成蟲時(shí)難度大的缺陷[10]。因此，本研究基于形態(tài)學(xué)特征和COI分子標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)庫蠓屬二囊亞屬的9個(gè)近似種進(jìn)行分析，驗(yàn)證了線粒體COI基因序列可作為庫蠓近似種的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的有效分子標(biāo)記。

昆蟲系統(tǒng)演化的研究是從分子水平上找出其種間DNA序列的特異性差異，以探索昆蟲種、屬間的相對(duì)親緣關(guān)系，同時(shí)也為昆蟲的分子鑒定奠定基礎(chǔ)[11-12]。在庫蠓近似種遺傳距離的研究結(jié)果中，種間遺傳距離 (0.154～0.302) 明顯大于種內(nèi)遺傳距離(0.000～0.019)，其中種內(nèi)最大遺傳距離0.019亦小于種間最小遺傳距離0.154，說明種間遺傳距離較大，足以區(qū)分不同物種，而種內(nèi)個(gè)體變異在一定范圍內(nèi)，沒有超出種的界限，進(jìn)而可以準(zhǔn)確區(qū)分二者，且種間是種內(nèi)的平均遺傳距離(0.258/0.0095)的27倍，完全符合種間差異大于種內(nèi)差異10倍的物種鑒定規(guī)則[13-14]。同時(shí)，林島庫蠓C.gaponus與無害庫蠓C.innoxius的種間遺傳距離為最小(K-2P：0.154)，這與其在形態(tài)學(xué)上為極度近似種的鑒定結(jié)果相符合。

本研究中庫蠓屬二囊亞屬的9種近似種的NJ樹和ML樹結(jié)果基本一致，但仍存在部分近似種的種間和種內(nèi)親緣關(guān)系的微小差異，然而造成這種差異的原因在于兩種建樹方法的理論基礎(chǔ)以及其建樹的偏向性方面存在差異。從本研究的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果可以得出：①內(nèi)群(二囊亞屬)與外群(荒川庫蠓C.arakawai)之間聚類分析明顯各自形成兩大支，同時(shí)其不同亞屬間遺傳距離也顯著大于亞屬間；②無害庫蠓C.innoxius與林島庫蠓C.gaponus首先聚在一起，親緣關(guān)系最近并構(gòu)成姐妹群，這與K-2P遺傳距離及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相一致，這進(jìn)一步證實(shí)了COI分子鑒定的可靠性；③利用不同的方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，荒川庫蠓C.arakawai的四個(gè)不同地理種群(重慶北碚區(qū)、廣西大瑤山自然保護(hù)區(qū)、貴州遵義市、四川瀘州市)均并為一支，形成同一單系(群)且與采自同一地理生境(海南鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū))下的林島庫蠓C.gaponus、連斑庫蠓C.jacobsoni、南山庫蠓C.lansangensis和新竹庫蠓C.liui等4個(gè)不同種之間并無交叉，各自形成一單系(群)，這充分表明以COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能有效區(qū)分不同地理種群的同一物種及同一地理生境下的不同物種。同時(shí)，近似種間各分支都有相對(duì)較高的置信值，說明近似種間的區(qū)分度好且可靠程度較高。然而，在種間和種內(nèi)一些分支上亦存在相對(duì)較低的置信值(低于50)，這可能是由于COI序列堿基組成及變異速度存在差異以及有效信息有限的短線粒體COI序列所致拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無法得到很好支持的原因[15]，故在今后的研究中應(yīng)從更豐富的樣本數(shù)量以及更全面的有效序列信息等方面著手。

目前，已有多個(gè)研究表明在對(duì)蚤目、同翅目和雙翅目(搖蚊科、麻蠅科)等昆蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)聯(lián)合mtDNA、rDNA以及形態(tài)學(xué)特征綜合分析得到的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果比單獨(dú)使用線粒體COI基因分析得到的結(jié)果更為理想，有研究表明聯(lián)合COI和Cytb基因進(jìn)行某類群鑒定的成功率高達(dá)99%[16-18]。當(dāng)然COI基因也并非在所有類群都適合進(jìn)行分類，如腔腸類動(dòng)物、馬達(dá)加斯加蛙類等類群就不適合使用COI作為分子標(biāo)記[9]。因此，聯(lián)合多個(gè)互補(bǔ)基因序列以及形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析可得到更為準(zhǔn)確的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果。另外，研究者們也在不斷探索發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記并應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育研究中，如編碼蛋白基因CAD序列，其在很大程度上更有利于分析昆蟲的進(jìn)化關(guān)系，且在庫蠓的分子系統(tǒng)學(xué)研究中具有很大的價(jià)值和應(yīng)用前景[19-22]。因此，在面對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子分類方法存在困難和局限時(shí)，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多個(gè)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)來對(duì)庫蠓的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行綜合分析，并積極探尋數(shù)量更多、效果更好的分子標(biāo)記來進(jìn)行更為科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)研究。

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