基于凝集素基因?qū)Σ糠蛛[孢子蟲種類的分子鑒定

，， ，，龍現(xiàn)，，，YANG Rongchang

隱孢子蟲是一種重要的人獸共患性原蟲，被認為是僅次于輪狀病毒的第二大重要的腹瀉病原體[1-3]，其宿主范圍廣泛，可引起急慢性及腸胃炎性腹瀉，嚴重程度與宿主自身的免疫狀態(tài)有關。隱孢子蟲也是因人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的艾滋病和器官移植的機會性病原體[4-5]。該病已被確定為引起人類腹瀉的6大病因之一，常通過水源或食源性污染造成暴發(fā)性流行，迄今為止仍無有效的治療藥物，對人類公共衛(wèi)生造成很大威脅[6]。目前隱孢子蟲有效種已達36種，C.parvum、C.hominis在人隱孢子蟲檢測中較為常見[7]，對這兩個種以及與它們相近種的隱孢子蟲種類的鑒定與分析應進行更深入的研究。目前常用的鑒定隱孢子蟲的基因工具是SSU rRNA[8]。該基因分類工具可以鑒別出多種隱孢子蟲種類，且由于基因的多拷貝特性，以及存在半保守和高變區(qū)域，適合于設計屬特異性引物。但SSU rRNA基因的不足之處在于不同拷貝間存在微小的序列差異，這有時會導致某一蟲種或基因型RFLP分析結果不一致[9]。因此，區(qū)別不同分離株不同拷貝序列內(nèi)部差異是很有必要的。

現(xiàn)有研究表明，糖結合蛋白或凝集素在原蟲識別和粘附宿主細胞過程中起介導作用，這將有助于隱孢子蟲的侵襲和致病[10-11]，其作用在某些寄生蟲上已經(jīng)得到了分析和驗證。這也提示了對黏蛋白樣糖蛋白的研究將成為隱孢子蟲致病機理的新方向。對于隱孢子蟲粘附素功能的研究已經(jīng)受到廣泛關注，而其在分子流行病學和遺傳結構分析上，該基因位點的作用仍然沒有被重視和挖掘。本實驗通過巢式PCR技術，對數(shù)種不同隱孢子蟲陽性樣品進行SSU rRNA及Lectin位點的擴增，并與其它已知的隱孢子蟲相關序列比對，構建系統(tǒng)進化樹。初步結果顯示:凝集素基因(Lectin)位點作為分型工具很好地區(qū)分了C.parvum、C.hominis、C.cuniculus及其在SSU rRNA 與人源C.hominis極為相近的horse genotype和驢源C.hominis，且Lectin基因?qū)Σ煌蛛x株不同拷貝間的微小序列差異的分析，比SSU rRNA有更好的區(qū)分度，為研究隱孢子蟲的種類和基因型提供參考。

1 材料與方法

1.1隱孢子蟲陽性樣品 試驗樣品共56份，包括實驗室保存已經(jīng)經(jīng)Nest-PCR(SSU rRNA)鑒定為陽性的52份樣品(16份C.parvum、16份人源C.hominis、5份驢源C.Hominis、1份驢源Horse genotype、4份C.andersoni、3個C.canis、3個C.muris、2個C.bailey和2個C.ubiquitum)，以及澳大利亞莫道克大學媒介與水傳病原研究團隊(Vector & Water-Borne Pathogen Research Group)保存的來源于袋鼠的 4份C.cuniculus，樣品信息見表1。

1.2主要試劑 反應體系中使用的酶為KOD-plus酶0.5 μL (日本TOYOBO公司生產(chǎn)，購于鄭州科貿(mào)生物技術有限公司)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系見表2。

1.3 PCR的擴增

1.3.1基于SSU rRNA(18s)位點的擴增 基于SSU rRNA基因?qū)λ嘘栃詷悠愤M行巢式PCR的擴增，參照Xiao等[12]的方法合成2對引物，見表2。PCR反應條件：94 ℃，5 min，1 個循環(huán)；94 ℃，45 s，55 ℃和55 ℃，45 s，72 ℃，1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min，1 個循環(huán)。每次PCR擴增均設陽性對照樣品和陰性對照樣品。電泳結束后在電泳凝膠成像系統(tǒng)儀中觀察拍照。

1.3.2基于凝集素基因位點的擴增 經(jīng)SSU rRNA擴增出的陽性樣品，用Lectin基因進行巢式PCR擴增。外引物的合成參照Alireza[13]的序列，內(nèi)引物用MacVector 12.6軟件合成，見表3。PCR反應條件：94 ℃，3 min，1 個循環(huán)；94 ℃，30 s，56 ℃和53 ℃，30 s，72 ℃，1 min，40個循環(huán)；72 ℃，10 min，1 個循環(huán)。每次PCR擴增均設陽性對照樣品和陰性對照樣品。電泳結束后在電泳凝膠成像系統(tǒng)儀中觀察拍照。

1.4測序 隱孢子蟲陽性樣品經(jīng)SSU rRNA和Lectin位點擴增后的第二套PCR產(chǎn)物，純化后直接進行測序。每個樣品均進行雙向測序，測序委托北京諾賽基因有限公司完成，測序儀為ABI PRISMTM 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。

表1 不同隱孢子蟲樣品信息

Tab.1 Information of different Cryptosporidium isolates

編號種類宿主來源編號種類宿主來源201C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA631C.hominisKangarooSydney,Australia207C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA718C.hominisCattleSydney,Australia224C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA782C.hominisKangarooSydney,Australia239C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA849C.hominisKangarooSydney,Australia329C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA663C.cuniculusRabbitSydney,Australia339C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA667C.cuniculusRabbitSydney,Australia431C.parvumCattleTianjin,ChinaSCA675C.cuniculusRabbitSydney,Australia123C.parvumDonkeyShandong,ChinaSCA678C.cuniculusRabbitSydney,AustraliaBDC.parvumCattleJilin,China268horsegenotypeDonkeyShandong,ChinaNXC.parvumCattleNingxia,ChinaS13C.hominisDonkeyShandong,China14793C.parvumHumanBritain89C.hominisDonkeyShandong,China15289C.parvumHumanBritain58C.hominisDonkeyShandong,China15324C.parvumHumanBritain59C.hominisDonkeyShandong,China15465C.parvumHumanBritain106C.hominisDonkeyShandong,China15490C.parvumHumanBritain355C.andersoniCattleHenan,China15389C.parvumHumanBritain362C.andersoniCattleHenan,China8C.hominisHumanHenan,China487C.andersoniCattleHenan,China23C.hominisHumanHenan,China524C.andersoniCattleHenan,China15479C.hominisHumanBritain8C.canisDogZhengzhou,China402C.hominisHumanHenan,China13C.canisDogZhengzhou,China14581C.hominisHumanBritain14C.canisDogZhengzhou,China14592C.hominisHumanBritain3C.baileyiDuckHenan,China14671C.hominisHumanBritain56C.baileyiDuckHenan,China14638C.hominisHumanBritain389C.ubiquitumSheepGansu,China15281C.hominisHumanBritain515C.ubiquitumSheepGansu,China15402C.hominisHumanBritain166C.murisHamsterZhengzhou,China15410C.hominisHumanBritain167C.murisHamsterZhengzhou,China15429C.hominisHumanBritain168C.murisHamsterZhengzhou,China

表2 PCR反應體系

Tab.2 PCR reaction system

第1次PCR反應體系第2次PCR反應體系試劑體積/μL試劑體積/μLBuffer2.5Buffer2.5dNTP2.5dNTP2.5Mg2+1.5Mg2+1.5上游引物(F1)0.5上游引物(F2)0.5下游引物(R1)0.5下游引物(R2)0.5KoDplus酶0.5KoDplus酶0.5滅菌雙蒸水16滅菌雙蒸水16DNA模版1第1次PCR產(chǎn)物1

表3 隱孢子蟲在SSU rRNA和Lectin位點進行擴增的引物

Tab.3 List of primers used in this study to amplify Cryptosporidium species at SSU rRNA and Lectin

基因引物序列5'-3'片段長度/bpSSUF1:TTCTAGAGCTAATACATGCG1325rRNAR1:CCCATTTCCTTCGAAACAGGAF2:GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG840R2:CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTALectinF1:TCAACTAACGAAGGAGGGGA656～668R1:GTGGTGTAGAATCGTGGCCTF2:CGTGCGAATGAAGAAAGA440～480R2:AATCGTGGCCTAAGAGTG

1.5種系發(fā)育分析 雙向測序后的樣品在GenBank上用Blast進行同源序列搜索，應用ClustalX 1.83軟件進行比對分析，對照比對結果和測序峰圖，獲得校準序列。種系發(fā)育進化樹使用MEGA5軟件建立，同時結合MegAlign建立的同源性結果進行序列的分析。

2 結 果

2.1PCR對不同隱孢子蟲種的擴增結果 經(jīng)Lectin基因引物共擴增了56份樣品，其中42份隱孢子蟲陽性樣品在SSU rRNA基因位點和Lectin位點均已成功擴出大小為440～480 bp的目的條帶，這些樣品分屬于C.parvum、C.hominis、C.cuniculus、Horse genotype。而C.andersoni、C.canis、C.muris、C.bailey和C.ubiquitum，在SSU rRNA位點能夠擴增目的序列，在Lectin位點卻未能擴增出目的條帶，基于Lectin擴增的部分隱孢子蟲種的凝膠成像圖，見圖1。在Lectin位點校準過的測序結果與GenBank僅有的幾條序列Blast結果相似。

M: DNA標準DL2000；1.8-C.hominis；2: 13-C.canis；3: 201-C.parvum；4: 89-C.hominis-Donkey；5: 268-horse genotype；6: SCA675-C.cuniculus；P:陽性對照；N:陰性對照圖1 部分隱孢子蟲種基于Lectin基因的擴增Fig.1 Amplification of partially Cryptosporidium species based on Lectin gene

2.2序列比對與同源性分析 將42份Lectin基因擴增產(chǎn)物測序結果進行分析，同時與參考序列[13]進行了比對，ClustulX比對結果顯示:不同種類的隱孢子蟲，重復序列堿基組成不同(數(shù)量不等的編碼谷氨酰胺的CAA三聯(lián)密碼子)，同種隱孢子蟲不同分離株或不同來源的重復序列數(shù)目不同，其中，C.parvum、C.hominis、C.cuniculus、驢源C.hominis和Horse genotype的連續(xù)的CAA個數(shù)見表4。此外，在6個C.parvumLectin位點序列中發(fā)現(xiàn)樣品431在56位點處堿基為T，而其它5個C.parvum的堿基為G，在302-307位點之間堿基缺失，其它5個C.parvum的堿基為ACTACC?？赡苁菢悠?31與其它5個C.parvum的亞型不同，其具體結果有待進一步的驗證。

由于比對序列較多，本文選取9個隱孢子蟲分離株的序列：C.parvum(201/15389)、C.hominis(15281/SCA782)、C.cuniculus(SCA675)、驢源C.hominis(89/106/S13-R)和Horse genotype(268-R)與參考序列KX375354.1、KX375352.1及KX375351.1 進行同源性的分析。參考序列信息見表5。

表4 部分不同隱孢子蟲種Lectin基因擴增后的連續(xù)CAA個數(shù)

Tab.4 Consecutive CAA numbers of different Cryptosporidium species based on Lectin gene

種類編號宿主連續(xù)CAA個數(shù)C.hominis14581Human2114592Human24SCA631Kangaroo21SCA782Kangaroo17SCA718Cattle17C.parvum207Cattle315490Human2C.cuniculusSCA678Rabbit21SCA663Rabbit21C.hominis106Donkey15Horsegenotype268Donkey8

表5 基于Lectin擴增的文中參考的序列信息

Tab.5 Reference sequence information based on Lectin gene[13]

參考序列種類宿主來源KX375354.1C.parvumCattleAustraliaKX375352.1C.hominisKangarooAustraliaKX375351.1C.cuniculusRabbitAustralia

同源性分析結果表明，在Lectin基因位點上C.parvum的這2個分離株，宿主來源不同，其中來源于牛的201號樣品與KX375354.1同源性為97.1%，而來源于人的15389號樣品與KX375354.1同源性為92.4%；C.hominis的兩個分離株間宿主來源不同，同源性高達99.8%，但與KX375352.1的同源性是100%；C.cuniculus與KX375351.1的同源性為100%；3個驢源C.hominis間同源性在99.1%～99.7%之間，與KX375352.1的同源性為98.8%。遺傳進化樹及同源性結果表明，同種隱孢子蟲因蟲株來源不同，顯示遺傳距離的遠近。見圖2。

注：括號中的樣品與代表樣品序列相同，處于同一分支上。SCA782-C. hominis-Kangaroo(8，23,402,14592,15281,15402,14581,15479,14671,14638,15410,15429,SCA718，SCA631,SCA849)201-C. parvum-Cattle(207,224,239,339,123,BD,NX,15389,15289,431,14793,15324,15465,15490,SCA642)SCA675-C. cuniculus-Rabbit(SCA678,SCA667,SCA663)S13-C. hominis-Donkey(89,58,59,106)圖2 部分隱孢子蟲Lectin基因序列與其參考序列基于鄰近法(NJ)構建的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of partial Cryptosporidium Lectin gene sequence with reference sequence based on the adjacent method (NJ)

3 討 論

3.1Lectin基因是編碼隱孢子蟲毒力因子的基因，其編碼的蛋白質(zhì)位于子孢子和裂殖子的頂端區(qū)域，可能與蟲體的黏附、侵入及胞內(nèi)的發(fā)展有關[14]。研究表明，在很多寄生性的原蟲中，凝集素Lectin或者與糖結合的蛋白質(zhì)都能介導原生動物黏附宿主細胞、增強細胞的毒性及補體的抗藥性，并能促進形成囊體或包囊壁[15-17]，可能與隱孢子蟲的致病性有關。本試驗是在嘗試使用Lectin基因位點作為分析工具時發(fā)現(xiàn)不同隱孢子蟲種類在該位點的序列不同，尤其是不同種隱孢子蟲有數(shù)量不等的CAA三聯(lián)密碼子重復序列，根據(jù)其他原蟲相關研究，如溶組織阿米巴凝集素蛋白對阿米巴致病力的影響[18]，推測該基因編碼蛋白影響隱孢子蟲的入侵、繁殖和致病力。在對Lectin位點進行引物的設計時，Lectin基因序列僅在C.parvum、C.hominis和C.cuniculus上有少量報道，而其他隱孢子蟲Lectin基因存在與否及序列特性知之甚少，為此本實驗選用全基因組序列中已上傳的全基因測序完成的C.parvum和C.hominis的Lectin基因作為研究對象，設計隱孢子蟲屬特異性的巢式PCR引物，試圖擴增出其他種的隱孢子蟲Lectin基因序列。試驗之初，曾對實驗室保存的其他隱孢子蟲如C.andersoni、C.baileyi、C.canis、C.ubiquitum、C.muris一并進行了擴增，但僅在C.parvum、C.hominis、C.cuniculus、horsegenotype擴增出了目的基因。分析原因，可能是設計Lectin基因引物是基于C.parvum、C.hominis的基因序列設計的，所以只能擴增出這兩個種或者與之相近的隱孢子蟲種或基因型。NCBI上已公布的全基因組序列中，C.muris在Lectin位點上與C.parvum、C.hominis序列差別很大，這也是C.muris等在本次試驗中無法擴增出目的條帶，而C.parvum、C.hominis及其相近蟲種可以順利擴增的主要原因。

3.2挑選本實驗中的11個樣品(6個C.parvum、2個C.hominis和3個驢源C.hominis)分別進行SSU rRNA和Lectin的擴增，將第二套擴增產(chǎn)物送去測序，拼接序列后進行ClustalX比對。比對結果顯示：在SSU rRNA位點處，僅能區(qū)分出不同的隱孢子蟲種，而同種隱孢子蟲不同分離株間的差別無法區(qū)分開來。而在Lectin位點處，能把C.parvum和C.hominis這兩個隱孢子蟲種及驢源C.hominis很好地區(qū)分開來。同時，通過用Lectin位點擴增C.parvum，C.hominis，C.cuniculus，horsegenotype，驢源、袋鼠源C.hominis幾種隱孢子蟲/基因型時，發(fā)現(xiàn)在不同種類的隱孢子蟲分離株中，其重復序列的堿基組成不同，同種隱孢子蟲不同樣品中重復序列的堿基數(shù)目不同。這也表明，Lectin基因有望成為新的隱孢子蟲標記基因，補充現(xiàn)有基因位點對隱孢子蟲分型分類的不足。

目前，國內(nèi)外將Lectin基因位點用于隱孢子蟲種類和基因型的鑒定，僅少量報道[13]。本文通過對不同隱孢子蟲分離株在Lectin位點進行擴增，并將部分隱孢子蟲種分別進行SSU rRNA和Lectin位點的擴增，以此來探討Lectin基因作為分型工具的可能性，旨在為隱孢子蟲流行病學調(diào)查、遺傳結構分析和疫病暴發(fā)溯源提供新的分子工具，并為未來篩選藥物防治隱孢子蟲病新的作用靶點和疫苗研發(fā)提供背景資料。本實驗中，經(jīng)序列比對及進化樹結果表明，Lectin基因作隱孢子蟲鑒定工具用于SSU rRNA 序列相近隱孢子蟲種的鑒定有更好的區(qū)分度，可望為隱孢子蟲的分子流行病學、群體遺傳分析增添新的分子工具，是目前隱孢子蟲分類工具的有益補充。

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