海南產(chǎn)Ganoderma lingzhi種質(zhì)的鑒定

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(海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院， 海南 三亞 572022)

靈芝是一類腐生型真菌，以腐解木質(zhì)素獲取營養(yǎng)，在分類學(xué)上將靈芝歸為多孔菌目，靈芝菌科，靈芝屬。野生靈芝菌蓋為半圓形、圓形、扇形等，常帶似漆樣光澤；菌肉顏色有淡黃色、黃褐色等[1]。由于靈芝生長環(huán)境多樣，造成了在生活史的不同階段均表現(xiàn)出豐富的形態(tài)，因此僅通過形態(tài)觀察難以對其進(jìn)行鑒定，往往需要結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析才能有效地對菌株的分類學(xué)地位進(jìn)行界定[2]。近年來，形態(tài)學(xué)結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定已廣泛應(yīng)用于靈芝分類。Hong等[3]采用mt SSU片段將37株靈芝分為5個類群，提出了亞洲原產(chǎn)赤芝類群。Cao等[4]通過ITS序列結(jié)合形態(tài)分析重新對靈芝屬下的菌株進(jìn)行鑒定，提出了G.lingzhi這一新的種群，明確了靈芝屬下不同種的界定，同時也為今后靈芝分類提供理論依據(jù)。G.lingzhi至今已在我國臺灣、遼寧、江蘇、浙江、湖北、山東、安徽、河南、天津、廣東、湖南、云南、四川、福建及日本發(fā)現(xiàn)有分布，然而據(jù)筆者了解，海南至今未見這個種的分布報道。本研究采用ITS、mt SSU序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)合形態(tài)分析，對收集自海南的3株靈芝種質(zhì)進(jìn)行分類鑒定，明確其為G.lingzhi，進(jìn)一步拓展了這個種在我國的分布范圍。

1 材料與方法

1.1 靈芝的收集及形態(tài)觀察

2015年5—10月于海南尖峰嶺地區(qū)收集靈芝種質(zhì)資源，進(jìn)行形態(tài)觀察，4 ℃冷藏保存。

1.2 基因組DNA提取、目的片段擴(kuò)增及測序

基因組DNA提取及目的片段擴(kuò)增參照Chen等[5]方法。ITS片段擴(kuò)增參照White等[6]方法。采用引物CFMT (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和CRMT (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增完整的mt SSU V 3，V 4區(qū)及部分V 2區(qū)。PCR產(chǎn)物委托北京華大基因科技股份有限公司測序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

根據(jù)ITS、mt SSU片段測序結(jié)果，Gen Bank中進(jìn)行Blast比對，搜索同源序列。選取不同種的代表性菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。采用Clustalx 1.83[7]將序列對齊，利用MEGA 5.05[8]軟件以最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以自展法(bootstrap)進(jìn)行檢測，循環(huán)1 000次。

2 結(jié) 果

本研究中3個菌株在形態(tài)上菌蓋呈半圓形，深紅色或紫紅色，菌蓋表面光滑(圖1)；有菌柄；擔(dān)孢子長寬分別為8.3～8.7μm和6.4～9.4μm，這些形態(tài)特征與G.lingzhi相似(表1)。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，根據(jù)ITS序列和mt SSU序列構(gòu)建的最大簡約樹具有相似結(jié)構(gòu)。ITS最大簡約樹：步長=107；一致性指數(shù)(CI)=0.687；總留存指數(shù)(RI)=0.908；mt SSU最大簡約樹：步長=41；一致性指數(shù)(CI)=0.827；總留存指數(shù)(RI)=0.925。除了模式菌種G.lucidum遺傳關(guān)系比較分散外，不同種靈芝在系統(tǒng)發(fā)育樹上具有明顯聚類，同種靈芝聚為一支。其中在基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，菌株Jfl 1502、Jfl 1513、Jfl 1515與G.lingzhi聚為一支，自展值為92；在基于mt SSU序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，菌株Jfl 1502、Jfl 1513、Jfl 1515與G.lingzhi聚為一支，自展值為62；顯示了這3個菌株與G.lingzhi具有較近的親緣關(guān)系。

注：a為Jfl 1502；b為Jfl 1513；c為Jfl 1515。圖1 靈芝子實體的形態(tài)特征

表1 靈芝的形態(tài)特征

菌株菌蓋顏色菌柄顏色孔口顏色 菌蓋特征擔(dān)孢子(μm)Ganodermasp.Jfl1502深紅色深紅色淡黃色表面光滑、半圓形(8.3～8.7)×(6.4～9.4)Ganodermasp.Jfl1513深紅色深紅色淡黃色表面光滑、半圓形(8.5～9.3)×(5.7～6.2)Ganodermasp.Jfl1515深紅色深紅色淡黃色表面光滑、半圓形(9.0～9.6)×(5.6～8.1)Ganodermalingzhi淡黃色、黃色、土黃色黃色、紫紅色淡黃色、稻草黃表面光滑、半圓形、扇形[(8～9)～(10.7～12)]×[(5.2～5.8)～(7～7.5)]

注：1 000次重復(fù)，自展值>50%。圖2 根據(jù)ITS和mt SSU序列構(gòu)建的靈芝最大簡約樹

3 討 論

本研究中3個靈芝子實體形態(tài)相似，菌蓋深紅色、表面光滑、半圓形，這些特征與G.lingzhi菌蓋形狀相似，但與其常見的淡黃色至土黃色菌蓋顏色有差異[4]。然而靈芝生長在森林中，氣候多樣，這可能造成靈芝菌蓋顏色的差異[9]。本研究中靈芝來源于海南尖峰嶺地區(qū)，雨水充足，而與至今在海南以外省份發(fā)現(xiàn)的G.lingzhi生長環(huán)境存在差異，這些也可能造成了菌蓋顏色的不同[4]。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析顯示，根據(jù)ITS序列和mt SSU序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)相似，不同種靈芝分別獨立聚類，其中3株菌株Jfl 1502、Jfl 1513、Jfl 1515與G.lingzhi聚為一支，并具有較高的自展值支持，反映了3株菌株與G.lingzhi親緣關(guān)系緊密。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹和形態(tài)特征的結(jié)果表明，這3個菌株在分類地位上屬于G.lingzhi。這個結(jié)果也反映了G.lingzhi北至遼寧，南至海南均有分布，展現(xiàn)了其分布的廣泛性。

參考文獻(xiàn)：

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各類文獻(xiàn)規(guī)范數(shù)據(jù)選項表

注：“√”為必備項，“0”為任選項，“*”為有則加項，“-”為不要求項。