HPLC法測定面包中丙酸鈣含量的不確定度評定

□ 董偉博 楊海軍 山東斯派克森檢測技術(shù)服務(wù)有限公司

測量不確定度是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，本文通過采用HPLC法測定了面包中丙酸鈣的含量，并對其相對擴展不確定度進行了評定。

丙酸鈣作為防腐劑可以添加在焙烤類食品中，限量為2.5g/kg(以丙酸計)。高效液相色譜法(HPLC)是測定食品中丙酸鈣的國家標(biāo)準方法。測量不確定度是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，用于表征賦予被測量之值的分散性。當(dāng)測量結(jié)果處于臨界值時食品檢驗機構(gòu)必須進行測量不確定度評定。本文對HPLC法測定面包中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定，計算出不確定度并報告了結(jié)果。

1 儀器、試劑、色譜分析條件

1.1 儀器

高效液相色譜儀，島津LC-20AT，附紫外檢測器和自動進樣器；高速冷凍離心機，北京雷勃爾LR10-2.4A；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器KQ-100；高速組織搗碎機，上海精科DS-1；pH計,上海儀電科學(xué)PHS-3C；電子天平，上海上天FA2004；溶劑過濾器及0.45μm微孔濾膜。

1.2 試劑

分析純磷酸（H3PO4）、分析純磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]、實驗室用超純水、食品添加劑丙酸鈣純度標(biāo)準物質(zhì)(GBW(E)100078)。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm,5μm,P.N.880975-914；流動相：1.5g/L；磷酸氫二銨溶液,用1mol/L磷酸溶液調(diào)pH為3.0(使用時配制)；經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10μL；紫外檢測器波長：214nm。

2 樣品處理與標(biāo)準溶液曲線的繪制

依據(jù)國家標(biāo)準GB 5009.120-2016進行試驗。

2.1 樣品制備

將面包樣品經(jīng)組織搗碎機搗碎混勻，準確稱取以上樣品5g（精確至0.0001g）至100mL燒杯中，加水20mL，加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，混勻；經(jīng)超聲浸提10min后，用1mol/L磷酸溶液調(diào)pH為3左右，轉(zhuǎn)移試樣至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。將試樣全部轉(zhuǎn)移至50mL具塞塑料離心管中，以不低于4000r/min的速度離心10min，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，待液相色譜測定。

2.2 標(biāo)準曲線的繪制

準確吸取5.0mL丙酸標(biāo)準貯備液(10mg/mL)于50mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,配制成濃度為1.0mg/mL標(biāo)準工作液。再準確吸取標(biāo)準工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL至10mL容量瓶中，分別加入1mol/L磷酸0.2mL，用水定容至10mL，混勻。其丙酸標(biāo)準溶液的最終濃度分別為0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。

3 測量數(shù)學(xué)模型

樣品中丙酸鈣含量(以丙酸計),按式（1）計算:

式中:

X為樣品中丙酸鈣的含量(以丙酸計),單位為克每千克(g/kg)；c是由標(biāo)準曲線得出的樣液中丙酸的濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL)；V是樣液最后定容體積,單位為毫升(mL)；m為樣品質(zhì)量,單位為克(g)；f是稀釋倍數(shù)。

注：試樣中測得的丙酸含量乘以換算系數(shù)1.2569，即得丙酸鈣含量。計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

4 根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析影響不確定度的因素

不確定因素有以下幾方面：①樣品稱量引起的不確定度；②樣品平行測定引起的不確定度；③樣品定容引入的不確定度；④標(biāo)準系列溶液配置引起的不確定度；⑤標(biāo)準曲線擬合引入的不確定度。

5 不確定度評定

5.1 樣品稱量引起的不確定度(B類不確定度)

本試驗所用電子天平為萬分之一，最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重復(fù)性標(biāo)準差0.3mg，天平重復(fù)性標(biāo)準差應(yīng)計算為2次。則=0.00043(g),稱樣量為5.0026g，相對不確定度為：Urel(m1)=u(m1)/m=0.00043/5.0026=8.6× 10-5；

5.2 樣品平行測定引起的不確定度（A類不確定度）

試驗中對同一樣品丙酸鈣的含量進行了3次平 行 測 定 其 結(jié) 果 分 別 為：1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg， 平 均 值X =1.08g/kg,標(biāo) 準 偏 差=

按均勻分布計算，其不確定度為UA=0.0158/

5.3 樣品定容體積引入的不確定度（B類不確定度）

20℃時50mL A級容量瓶的允許誤差為±0.05mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為u=0.05/=0.0289mL；50mL A級容量瓶重復(fù)充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差系數(shù)C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10-2mL；試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數(shù)為2.1× 10-4，溫差變化引起體積的變化為：50 ×2×2.1× 10-4=0.021mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.021/=0.0121mL。

則樣品定容引入的相對不確定度Urel(v1)=/50=6.8 × 10-4。

5.4 標(biāo)準系列溶液配制引入的不確定度(B類不確定度)

5.4.1 標(biāo)準儲備液引入的不確定度

①丙酸鈣標(biāo)準品的純度，證書上給出的純度99.7%，不確定度為0.6%，則標(biāo)準物質(zhì)引入的不確定度0.006/=0.0035。

②本試驗所用電子天平為萬分之一，最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重復(fù)性標(biāo)準差0.3mg，天平重復(fù)性標(biāo)準差應(yīng)計算為2次。則=0.00043(g),稱 標(biāo)準品為0.3146g，則由稱量引入的相對不確定度為：0.00043/0.3146=0.0014。

③標(biāo)準物質(zhì)稀釋引入的不確定度

a.20℃時25mL A級容量瓶的允許誤差為±0.03mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為0.03/=0.0173mL。

b.25mL A級容量瓶重復(fù)充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差系數(shù)C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3 ×10-2mL。

試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數(shù)為2.1 ×10-4，溫差變化引起體積的變化為：25× 2 ×2.1× 10-4=0.0105mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.0105/=0.0061mL。則標(biāo)準儲備液由稀釋引入的相對不確定度：Urel(v2)=/25=0.0009， 由 此， 丙酸鈣標(biāo)準儲備液引入的不確定度為：Urel(標(biāo)儲)==0.0039。

5.4.2 標(biāo)準系列溶液由稀釋引入的不確定度

①由5mL A級單標(biāo)移液管引起的相對不確定度來自三個分量

a.5mL A 級單標(biāo)移液管引的容量誤差查證書為±0.015mL，按均勻分布，不確定度為0.015/=8.7× 10-3(mL)。

b.5mL A級單標(biāo)移液管的充液重復(fù)性引起的不確定度，重復(fù)充液兩次，用極差計算，其極差為R=0.015mL,由極差系數(shù)C及自由度υ，則由充液引入的不確定度為0.015/1.13=0.013(mL)。

c.試驗溫度變化為±2℃，水的體積在20℃膨脹系數(shù)為2.1×10-4，按均勻分布，由溫度變化引入的不確定度為2.1×10-4×5× 2/=0.0012(mL)，則5mL A級單標(biāo)移液管體積引入的不確定度為=0.016(mL)，由此，5mL A級單標(biāo)移液管體積引入的相對不確定度為0.016/5.00=0.0032。

②標(biāo)液定容體積引入的不確定度

a. 50mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度。

a1.20℃時50mL A級容量瓶的允許誤差為±0.05mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為0.05/=0.0289mL。

b1.50mL A級容量瓶重復(fù)充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10-2mL。

c1.試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數(shù)為2.1×10-4，溫差變化引起體積的變化為：50×2×2.1×10-4=0.021mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.021/=0.0121mL。

由此，50mLA級容量瓶體積引入的相對不確定度為/50=6.8 ×10-4

b.10mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度

a1.20℃時10mL A級容量瓶的允許誤差為±0.02mL,按均勻分布計算，由此帶來的不確定度為0.02/=0.0115mL。

b1.10mL A級容量瓶重復(fù)充液2次，用極差計算，其極差為R=0.015mL，由極差系數(shù)C及自由度υ，則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10-2mL。

c1.試驗溫度為20±2℃，水的體積在20℃膨脹系數(shù)為2.1×10-4，溫差變化引起體積的變化為：10×2×2.1 ×10-4=0.0042mL，按均勻分布計算，溫度變化引起的不確定度為：0.0042/=0.0024mL。

由此，10mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度為：

至此，標(biāo)準系列溶液由稀釋引入的不確定度：Urel(v5)==0.018

5.5 標(biāo)準曲線擬合引起的不確定度

采用7個濃度水平丙酸鈣標(biāo)準溶液，得出峰面積，用最小二乘法擬合，得到標(biāo)準曲線

Y=175471x+2485.6，本試驗對同一樣品進行了3次測量，求得平均值X=1.08g/kg，因此由標(biāo)準曲線擬合帶來的標(biāo)準不確定度為：

式中：SR回歸曲線的剩余標(biāo)準差，b為斜率，p為待測樣品的重復(fù)測定次數(shù)(p=3),n為回歸曲線的點數(shù)n=7，c待測樣品濃度的平均值，c0為回歸曲線各點濃度的平均值，c0i為各標(biāo)準溶液濃度值。

其中，=0.22mg/mL，

式中：A0j為各標(biāo)準溶液的實際相應(yīng)值，為根據(jù)回歸曲線算出來的理論值。

表1 峰面積隨濃度的變化值

圖1 峰面積隨濃度的變化曲線

由上述表中數(shù)據(jù)計算出SR回歸曲線的剩余標(biāo)準差，即：

/kg則Urel(cal)=0.011/1.08=0.010

由標(biāo)準物質(zhì)及曲線擬合產(chǎn)生的不確定度為：

B類不確定度為Ucrel(B)=

合成不確定度：

擴展不確定度：取p=95%，kp=2，則U=uck=0.025×2=0.05g/kg

報告結(jié)果：1.08±0.05g/kg(k=2)

不確定度表達測量結(jié)果的分散程度，是一個定量的概念，可以用定量的數(shù)字描述。本文對 HPLC法測定面包中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定，若檢測結(jié)果處于標(biāo)準限量的臨界值或標(biāo)準方法有要求時，必須結(jié)合不確定對檢測結(jié)果進行評判。