白細(xì)胞介素35在腎癌中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的相關(guān)性研究

王 靜，楊立宏

(內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院腎內(nèi)科 024000)

近年來(lái)，腎細(xì)胞癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，約占腎惡性腫瘤的80%～90%，以及成人實(shí)體腫瘤的2%～3%。臨床上可通過(guò)手術(shù)切除治療腎細(xì)胞癌，但是仍有高達(dá)30%～40%的患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[1]。有資料顯示，腎癌的高發(fā)年齡為40～55歲，以透明腎細(xì)胞癌為主，約占腎癌的85%[2]。國(guó)內(nèi)外有些研究表明機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病有關(guān)[3-4]。目前腎癌的治療方法仍在不斷的研究中，如靶向藥物治療等，但是很多晚期腫瘤患者未能得到有效解決及治療。隨著科技的發(fā)展，關(guān)于細(xì)胞因子研究越來(lái)越多，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于機(jī)體免疫反應(yīng)生理及病理意義認(rèn)識(shí)有了進(jìn)一步提高。白細(xì)胞介素-35(IL-35) 是一種抗炎性細(xì)胞因子，能夠參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。IL-35大部分是由T細(xì)胞分泌，是T 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子。許白葉等[5]報(bào)道稱(chēng)，IL-35在多種腫瘤組織中存在高表達(dá)的情況，能夠促進(jìn)腫瘤組織部位血管增生。本研究對(duì)IL-35在腎癌中的表達(dá)水平及其與腎癌臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2016年10月間于本院擇期行手術(shù)治療的腎透明細(xì)胞癌患者60例(腎透明細(xì)胞癌組)，收集其臨床資料，及腫瘤組織和癌旁組織的標(biāo)本。另取同期于本院健康查體中心行健康查體的50例健康志愿者為對(duì)照組。腎透明細(xì)胞癌組中男38例，女22例，年齡(53.16±7.92)歲；觀(guān)察組中男31例，女19例，年齡(52.37±8.57)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)非透明細(xì)胞腎癌及LPRAML診斷符合WHO制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料完善；(3)自愿參加本研究，并簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受過(guò)內(nèi)分泌治療；(2)術(shù)前存在急慢性炎癥；(3)既往腫瘤病史。本研究已由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1收集和處理標(biāo)本 全部受試者在接受治療前均采集空腹時(shí)外周靜脈血樣本5 mL，置于抗凝管中。水平離心機(jī)2 500 r/min離心20 min，取上層血清置于 EP 管中保存在-80 ℃。剩余的血液樣本加入紅細(xì)胞裂解液10 mL，反應(yīng)8 min后2 500 r/min水平離心10 min，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，置于2 mL EP管中，加入1 mL TRIzol，-80 ℃保存。收集術(shù)中新鮮標(biāo)本組織，包括腫瘤組織、癌旁組織及正常腎臟組織，儲(chǔ)存轉(zhuǎn)運(yùn)使用液氮罐，置于-80 ℃保存。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中IL-35水平 使用人IL-35 ELISA 試劑盒檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌組及對(duì)照組血清中IL-35水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，所有樣本均檢測(cè)2次取平均值。實(shí)際水平計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品水平為縱坐標(biāo)，光密度(OD)值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)水平，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際水平。

1.2.2.2實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè) 提取PBMCs及腎組織細(xì)胞中總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定細(xì)胞中IL-35相關(guān)的EB病毒誘導(dǎo)基因3(EBI3)及亞基免疫因子53(p35)表達(dá)水平?？俁NA提取使用RNA提取試劑盒，實(shí)時(shí)定量PCR引物序列如下，EBI3上游5′-GCTCCCTACGTGCTCAAT-3′,下游5′-CCCTGACGCTTGTAACGG-3′；p35上游5′-TCCTCCCTTGAACCGGAA-3′，下游5′-TGACAACGGTTTGGAGGG-3′。

1.2.2.3免疫熒光染色觀(guān)察 IL-35在腎癌組織及正常組織中的表達(dá)。對(duì)腎透明細(xì)胞癌組織及正常腎癌組織進(jìn)行了EBI3及P35的免疫熒光染色，分別為FITC標(biāo)染抗p35抗體，而RITC標(biāo)染抗EBI3抗體。

2 結(jié) 果

2.1患者臨床資料比較 腎透明細(xì)胞癌患者平均腫瘤直徑為(4.30±2.31)cm；TNM-T分期中T1期 36例，T2期13例，T3期9例，T4期2例；腫瘤分期Ⅰ期37例，Ⅱ期10例，Ⅲ期11例，Ⅳ期2例。兩組患者在年齡及性別方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組血清IL-35水平比較 腎透明細(xì)胞癌組血清中IL-35為(107.52±56.83)pg/mL，對(duì)照組為(66.25±17.33)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.326，P=0.015)。不同年齡及性別的患者的血清中IL-35水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的IL-35水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 IL-35表達(dá)量與腎癌的臨床病例特征間的關(guān)系

A:兩組PBMCs中EBI3及p35的表達(dá)量；B：在腎透明細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常腎組織的EBI3及p35的表達(dá)量

圖1 EBI3及p35表達(dá)量比較

圖2 兩組IL-35亞基表達(dá)量

圖3 ROC曲線(xiàn)結(jié)果

2.3患者mRNA水平上EBI3及p35表達(dá)量對(duì)比 在mRNA水平上，腎透明細(xì)胞癌組PBMCs中EBI3及p35的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。腎癌組織、癌旁組織及正常腎組織之間EBI3及p35的表達(dá)量比較，腎癌組織中的EBI3及p35的表達(dá)量均明顯高于癌旁組織和正常組織，見(jiàn)圖1。

2.4兩組EBI3及p35表達(dá)量對(duì)比 EBI3及p35在腎透明細(xì)胞癌組中均呈現(xiàn)高表達(dá)，明顯高于對(duì)照組中的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.316，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.5腎透明細(xì)胞癌組ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果 最佳截點(diǎn)為IL-35 80.13 pg/mL時(shí)，曲線(xiàn)下面積為0.776，在診斷方面，其靈敏度為61.3%，特異度為91.1%，診斷正確率為73.2%，見(jiàn)圖3。

3 討 論

IL-35是一種由p35及EBI3兩個(gè)亞基組成的免疫抑制細(xì)胞因子，由EBI3蛋白和p35亞基組成的異源二聚體，是IL-12家族的新成員[6]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-35是重要的抗炎因子，對(duì)機(jī)體的自身免疫疾病及調(diào)節(jié)移植排斥等方面均發(fā)揮著重要作用[7]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于IL-35與免疫性疾病的相關(guān)研究也較多，也比較深入，而與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)研究較少。IL-35與多種腫瘤疾病具有相關(guān)性，如皮膚黑色素瘤及鼻咽癌等均發(fā)現(xiàn)IL-35的表達(dá)。IL-35能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖，抑制輔助性T細(xì)胞17型(Th17)細(xì)胞的分化，能夠改善膠原性關(guān)節(jié)炎臨床癥狀。DONG等[8]經(jīng)研究證實(shí)IL-35在胸膜結(jié)核性胸腔積液中表達(dá)量較高?？偨Y(jié)最近國(guó)內(nèi)外關(guān)于IL-35的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸中起重要作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)IL-35能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)并提高腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性[9]。但目前關(guān)于IL-35在腎臟惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用的研究較少，有待進(jìn)一步研究。

ZHANG等[10]研究報(bào)道經(jīng)實(shí)驗(yàn)在腫瘤微環(huán)境中檢測(cè)到IL-35及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)腎癌患者的血清IL-35水平明顯高于健康志愿者，與ZHANG等[10]的結(jié)論部分一致。本文通過(guò)繪制ROC曲線(xiàn)判斷IL-35對(duì)腎透明細(xì)胞癌的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)IL-35水平能夠作為一種新指標(biāo)來(lái)診斷腎癌，最佳截點(diǎn)為IL-35 80.13 pg/mL，其靈敏度為61.3%、特異度為91.1%，診斷正確率為73.2%。JIN等[11]曾發(fā)表文章稱(chēng)胰腺導(dǎo)管腺癌患者的血清中IL-35水平明顯升高，IL-35參與了疾病的病理生理過(guò)程。此外也有研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于黑色素瘤及結(jié)腸癌組織的研究，均發(fā)現(xiàn)IL-35水平增加，IL-35能通過(guò)抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫。此外，IL-35能夠促進(jìn)腫瘤血管的增生，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[12-13]。IBUSUKI等[14]曾報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者的血清IL-35水平與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血清IL-35水平與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與IBUSUKI的研究結(jié)果部分一致。腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷癌癥患者預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)，所以本研究認(rèn)為血清中IL-35水平可以在一定程度上反映腎透明細(xì)癌的預(yù)后。

本研究對(duì)IL-35 mRNA在腎癌中的表達(dá)水平也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌組外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-35的亞基(EBI3及p35)的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組；而腎癌組織中的EBI3及p35的表達(dá)量均明顯高于癌旁組織和正常組織。體內(nèi)IL-35由Treg分泌，有免疫負(fù)調(diào)控的作用，通過(guò)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其他多種組織也可以表達(dá)IL-35。有研究證實(shí)EBI3在急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞及霍奇金淋巴瘤中均表達(dá)升高[15-16]。本研究認(rèn)為臨床上推廣通過(guò)腎臟穿刺活檢，檢測(cè)IL-35 mRNA有一定的困難，建議推廣應(yīng)用血液中檢測(cè)IL-35水平來(lái)判斷疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后，也更加方便快捷。

綜上所述，IL-35在腎透明細(xì)胞癌患者的外周血及組織中均明顯升高，血清中IL-35水平與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，能夠在一定程度上反映腎透明細(xì)胞癌預(yù)后。本研究為單中心研究，且樣本數(shù)量較少，建議進(jìn)行多中心合作，擴(kuò)大樣本數(shù)量，進(jìn)一步研究IL-35的具體功能及相關(guān)機(jī)制。

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