通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對產(chǎn)后抑郁大鼠行為和下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

張貴鋒 吳曉玲 曾統(tǒng)軍 于玉珊 曾藝文 李力強

1肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（廣東肇慶 526020）；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院（廣東佛山 528300）

產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression，PPD）是指產(chǎn)婦分娩早期出現(xiàn)的以哭泣、憂郁、疲乏、易怒、焦慮、沮喪、悲哀等一系列癥狀為特征的心理障礙，一般發(fā)生在產(chǎn)后6周內(nèi)［1］。國內(nèi)PPD發(fā)生率為13.1%～16.3%，不僅嚴(yán)重危害產(chǎn)婦身心健康、家庭和諧，對嬰兒生長發(fā)育、心理行為、氣質(zhì)等方面也有不良影響，甚至出現(xiàn)自殺和殺嬰［2］。既往曾有文獻報道針灸對PPD有顯著療效［3］，筆者在臨床實踐中運用通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕治療PPD亦取得較為顯著的療效，但作用機制尚不明確。研究［4］表明，機體下丘腦?垂體?腎上腺（hypotha?lamic pituitary adrenal，HPA）軸紊亂是促進PPD發(fā)生的重要機制。那么，通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕是否可能通過調(diào)節(jié)HPA軸來改善產(chǎn)婦抑郁狀態(tài)呢？因此，筆者開展了本研究，以PPD模型SD大鼠為研究對象，通過觀察通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對其行為及HPA軸激素水平的影響，進一步揭示該方法對PPD的療效，并闡明其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性SD大鼠，SPF級，3月齡，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK＜粵＞2016?0041），體質(zhì)量（200±20）g。實驗過程中自由攝食和飲水（術(shù)前禁食，蔗糖水實驗前禁水）。飼養(yǎng)室保持20～22℃恒溫，相對濕度60%～80%，12 h光照和黑夜循環(huán)。

1.2 主要儀器 全自動酶標(biāo)儀（WD?2102A型，北京六一生物科技有限公司），放射免疫計數(shù)器（GC?1500，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），全自動高速離心機（Micro21，美國熱電公司）。

1.3 藥品與試劑 黃芪20 g、藿香15 g、石菖蒲15 g、皂角（煨）10 g、干姜5 g、肉桂5 g、丁香10 g、小茴香15 g、蘇合香5 g、雄黃2 g、粗鹽100 g（中藥飲片購于肇慶醫(yī)專附屬醫(yī)院，四會市天天邦健中藥飲片有限公司生產(chǎn)；粗鹽購于網(wǎng)絡(luò)，萊州市海盟鹽化有限公司生產(chǎn)），干燥、粉碎過80目篩，炒制，制成藥鹽備用。

鹽酸氟西汀膠囊（禮來蘇州制藥有限公司，批號4407A），臨用時溶于蒸餾水配置成濃度為0.25 mg/mL的藥液。苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液（均為廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)，批號分別為160711和160803）。

大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotro?pin?releasing hormone，CRH）ELISA檢測試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司，批號20161104），促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放射免疫試劑盒、皮質(zhì)醇（cortisol，Cor）放射免疫試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號20161006）。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，進行曠場（Open?Field）測試，根據(jù)評分結(jié)果篩選合格大鼠120只，采用隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組，每組20只。造模成功后，在干預(yù)開始后的第2、4周末設(shè)2個觀察時間點，各組每個時間點隨機選取大鼠10只進行指標(biāo)檢測。

1.3.2 造模方法 模型組、藥物組、常規(guī)針刺組和實驗組大鼠參照MEHTA等［5］報道的方法進行造模，腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，0.4 mL/100 g）后左側(cè)位固定在手術(shù)臺上，在脊柱旁開1橫指、肋緣后1橫指部位備皮、消毒，自腰椎沿背部正中線向下縱行切開1 cm，依次將雙側(cè)子宮角拉出體外，在卵巢下方和子宮連接處做兩個結(jié)扎，然后摘除卵巢，將子宮體送回腹腔縫合好，切口消毒并以棉簽涂慶大霉素。假手術(shù)組手術(shù)操作步驟同上，但不切除雙側(cè)卵巢，僅摘取卵巢周圍少許脂肪組織?？瞻捉M不予任何處理。

采用超快速改良巴氏染色法對切除卵巢后的大鼠每日做陰道細(xì)胞學(xué)涂片檢測，每日1次，連續(xù)7 d，有變化者表示卵巢未切除干凈，激素水平正在恢復(fù)，剔除不用。陰道涂片檢查合格的大鼠，每天定時皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 mg和黃體酮4 mg，連續(xù)16 d；第17天起，每天皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg，連續(xù)7 d；模擬大鼠妊娠狀態(tài)下的激素分泌水平。第24天（“產(chǎn)后”第2天）停止注射雌激素。空白組、假手術(shù)組大鼠前16 d每日皮下注射植物油0.3 mL，后7 d每日注射植物油0.1 mL。

1.3.3 干預(yù)方法 藥物組：將配置好的鹽酸氟西汀膠囊藥液以1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組：給予等容量蒸餾水灌胃。實驗組：固定好大鼠，選取百會穴、大椎穴、氣海穴、關(guān)元穴，常規(guī)消毒后用0.25 mm×13 mm針灸針進行針刺，刺至所需深度后均勻捻轉(zhuǎn)30 s，接通G6805?Ⅰ型電針儀，頻率15 Hz，連續(xù)波，電流強度約1 mA，以大鼠安靜耐受為度，每次20 min。電針結(jié)束后即進行隔藥鹽灸，將藥鹽用蒸餾水濕潤，均勻鋪在大鼠神闕穴部位，再將艾炷放在藥鹽上施灸。連續(xù)施灸3壯，約20 min，防止?fàn)C傷。每日治療1次。常規(guī)針刺組：固定好大鼠，選取百會穴、太沖穴，常規(guī)消毒后用0.25 mm×13 mm針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)，批號20150812）進行針刺，刺至所需深度后均勻捻轉(zhuǎn)30 s，接通G6805?Ⅰ型電針儀，頻率15 Hz，連續(xù)波，電流強度約1 mA，以大鼠安靜耐受為度，每次20 min。大鼠取穴參照《實驗針灸學(xué)》［6］。

各組大鼠在干預(yù)開始后的第2、4周末兩個時間節(jié)點，先進行相關(guān)行為學(xué)測試，然后處死取材，每次處死10只。在處死之前，相應(yīng)干預(yù)措施繼續(xù)。

1.3.4 指標(biāo)觀測方法

1.3.4.1 行為學(xué)觀察 蔗糖水消耗：測試前禁水24 h，各組大鼠自由飲用1%蔗糖水1 h，計算每只大鼠的蔗糖水消耗量。曠場試驗：以大鼠穿越方格數(shù)作為水平活動得分，以直立次數(shù)作為垂直活動得分；室內(nèi)隔音，每只大鼠測定1次，每次5 min，記錄水平活動與垂直活動得分。強迫游泳測試：將大鼠置于水深15～18 cm的圓柱形透明容器中進行預(yù)游泳15 min，取出、烘干后放回籠中飼養(yǎng)，24 h后將大鼠再次置于泳池中進行5 min的“游泳測試”，在攝像機下觀測并記錄游泳時間、掙扎時間、不動時間，強迫游泳不動時間以反映其絕望狀態(tài)。

1.3.4.2 血清指標(biāo)檢測 血清CRH采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測，血清ACTH、Cor采用放射免疫法（RIA）檢測。檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0 for windows軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析（One way ANO?VA），組間兩兩比較采用LSD（least significant dif?ference）檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對PPD大鼠行為學(xué)的影響

2.1.1 各組大鼠糖水消耗量 藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組糖水消耗量呈上升趨勢，模型組呈下降趨勢。假手術(shù)組與空白組糖水消耗量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組和常規(guī)針刺組第2、4周均低于空白組（P＜0.05）；藥物組和實驗組第2周低于空白組（P＜0.05），但第4周差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)過4周的干預(yù)，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組糖水消耗量顯著高于模型組（P＜0.05），實驗組顯著高于藥物組和常規(guī)針刺組（P＜0.05）。見表1。

2.1.2 各組大鼠曠場實驗水平活動評分 假手術(shù)組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型組、藥物組、常規(guī)針刺組第2、4周均低于空白組（P＜0.05）；實驗組第2周低于空白組，而第4周與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第2、4周藥物組、實驗組得分均高于模型組（P＜0.05），第4周常規(guī)針刺組評分亦顯著高于模型組（P＜0.05）。經(jīng)過4周的干預(yù)，實驗組評分顯著高于常規(guī)針刺組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠糖水消耗量的比較Tab.1 Comparison of sugar consumption of rats in each group ±s，mL

表1 各組大鼠糖水消耗量的比較Tab.1 Comparison of sugar consumption of rats in each group ±s，mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與藥物組比較，#P＜0.05；與常規(guī)針刺組比較，○P＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組藥物組常規(guī)針刺組實驗組第2周17.83±6.41 16.92±5.17 7.34±4.12*11.05±2.86*10.04±5.14*12.06±4.30*第4周18.96±3.50 18.54±3.83 4.15±2.45*15.19±3.46Δ 14.25±3.57*Δ 17.52 ± 3.84Δ#○

表2 各組大鼠曠場實驗水平活動評分比較Tab.2 The comparison of activity score in open?field test among rats in each group ±s

表2 各組大鼠曠場實驗水平活動評分比較Tab.2 The comparison of activity score in open?field test among rats in each group ±s

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與常規(guī)針刺組比較，○P＜0.05

常規(guī)針刺組實驗組32.78±10.51*40.83±8.60*△**△38.63±12.81*△48.27 ± 10.54△○

2.1.3 各組大鼠曠場實驗垂直活動評分 假手術(shù)組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組評分顯著低于空白組（P＜0.05），藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組評分均顯著高于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠曠場實驗垂直活動評分比較Tab.3 The comparison of vertical activity score in open-field test among each group of rats ±s

表3 各組大鼠曠場實驗垂直活動評分比較Tab.3 The comparison of vertical activity score in open-field test among each group of rats ±s

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組藥物組常規(guī)針刺組實驗組第2周16.52±3.04 15.23±3.60 7.11±2.37*11.14± 3.45△11.08± 3.40△11.97± 3.28△第4周17.19±3.52 14.16±4.21 8.74±4.25*15.96±4.33△14.46±3.12△14.50±5.23△

2.1.4 各組大鼠強迫游泳不動時間時長 假手術(shù)組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組第2周不動時間均長于空白組（P＜0.05），第4周模型組、常規(guī)針刺組不動時間長于空白組（P＜0.05），藥物組和實驗組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第2、4周藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組不動時間均短于模型組（P＜0.05），常規(guī)針刺組顯著長于藥物組（P＜0.05），實驗組顯著短于藥物組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠強迫游泳不動時間時長比較Tab.4 The comparison of forced swimming immobility time among rats in each group ±s，s

表4 各組大鼠強迫游泳不動時間時長比較Tab.4 The comparison of forced swimming immobility time among rats in each group ±s，s

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與藥物組比較，#P＜0.05；與常規(guī)針刺組比較，○P＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組藥物組常規(guī)針刺組實驗組第2周68.23±12.80 65.17±11.13 161.34±32.46*119.41±20.32*Δ 127.05 ± 13.54*Δ#98.50 ± 17.01*Δ○第4周67.52±14.66 68.23±16.35 174.50±28.64*88.12±15.44Δ 99.06 ± 18.71*Δ#90.41 ± 21.35Δ○

2.2 通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對PPD大鼠HPA軸激素水平的影響

2.2.1 各組大鼠血清CRH水平 假手術(shù)組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組第2周CRH水平均高于空白組（P＜0.05），第4周模型組、常規(guī)針刺組仍高于空白組（P＜0.05），藥物組、實驗組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。藥物組、實驗組兩個時間點CRH水平均低于模型組（P＜0.05），常規(guī)針刺組第2周與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而第4周低于模型組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清CRH水平Tab.5 Serum CRH levels in rats of each group ±s，pg/mL

表5 各組大鼠血清CRH水平Tab.5 Serum CRH levels in rats of each group ±s，pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，ΔP＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組藥物組常規(guī)針刺組實驗組第2周60.05±5.94 58.48±6.87 80.77±8.45*71.92±7.33*Δ 75.81±8.04*72.08±7.35*Δ第4周58.71±6.02 59.72±6.31 82.28±11.43*65.15±7.08Δ 72.20±6.97*Δ 64.61±5.32Δ

2.2.2 各組大鼠血清ACTH水平 假手術(shù)組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，除實驗組外其余各組血清ACTH水平第2、4周均高于空白組（P＜0.05），實驗組第2周高于空白組（P＜0.05），但第4周與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。藥物組、實驗組血清ACTH水平第2、4周均低于模型組（P＜0.05），常規(guī)針刺組第2周與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但第4周顯著低于模型組（P＜0.05）。第4周實驗組血清ACTH水平顯著低于藥物組和常規(guī)針刺組（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清ACTH水平Tab.6 Serum ACTH levels in rats of each group ±s，pg/mL

表6 各組大鼠血清ACTH水平Tab.6 Serum ACTH levels in rats of each group ±s，pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與藥物組比較，#P＜0.05；與常規(guī)針刺組比較，○P＜0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組藥物組常規(guī)針刺組實驗組第2周40.28±4.34 41.65±4.41 60.02±5.71*52.44±5.08*△57.85±4.97*48.16±4.33*△第4周41.50±3.87 40.86±3.92 62.01±5.14*47.85±5.28*△50.15±4.50*△42.17 ± 4.86△#○

2.2.3 各組大鼠血清Cor水平 假手術(shù)組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型組、藥物組、常規(guī)針刺組血清Cor水平第2、4周均高于空白組（P＜0.05），實驗組兩個時間點均與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組血清Cor水平兩個時間點均顯著低于模型組。第4周實驗組血清Cor水平顯著低于藥物組和常規(guī)針刺組（P＜0.05）。見表7。

表7 各組大鼠血清Cor比較Tab.7 The comparison of serum Cor among rats in each group ±s，pg/mL

表7 各組大鼠血清Cor比較Tab.7 The comparison of serum Cor among rats in each group ±s，pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與藥物組比較，#P＜0.05；與常規(guī)針刺組比較，○P＜0.05

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3 討論

相關(guān)研究表明，正常大鼠對蔗糖水消耗量較大，飲用快感明顯；曠場實驗水平及垂直活動均有較高評分，強迫游泳實驗不動時間較短［7?8］。在本研究中，模型組大鼠的糖水消耗量、曠場實驗水平和垂直活動評分均顯著低于空白組，強迫游泳實驗不動時間顯著長于空白組，假手術(shù)組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明造模成功。經(jīng)過2～4周的治療，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠的糖水消耗量以及曠場實驗水平和垂直活動評分顯著高于模型組，強迫游泳實驗不動時間顯著短于模型組，表明3種干預(yù)方法均能有效改善PPD模型大鼠的抑郁癥狀。經(jīng)過4周的干預(yù)治療，除了曠場實驗垂直活動評分外，實驗組的各項指標(biāo)均顯著優(yōu)于藥物組和常規(guī)針刺組，表明通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對PPD大鼠的抑郁表現(xiàn)有顯著的改善作用。

研究［9］表明，各種抑郁癥亞型的發(fā)病都伴隨單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸功能失調(diào)、神經(jīng)營養(yǎng)因子和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)機制。在本研究中，大鼠行為學(xué)測試提示造模成功，模型組大鼠血清CRH、ACTH、Cor水平均顯著高于空白組，證實PPD與HPA軸相關(guān)激素血清CRH、ACTH、Cor水平升高有密切關(guān)系。經(jīng)過4周的干預(yù)治療，藥物組、常規(guī)針刺組、實驗組大鼠血清CRH、ACTH、Cor含量均顯著低于模型組，表明藥物或者針刺治療PPD與調(diào)節(jié)HPA軸相關(guān)激素水平有關(guān)。第4周實驗組大鼠血清ACTH、Cor水平顯著低于藥物組和常規(guī)針刺組，血清CRH、ACTH、Cor水平與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕對PPD大鼠血清CRH、ACTH、Cor水平有顯著調(diào)節(jié)作用，且療效優(yōu)于常規(guī)針刺和鹽酸氟西汀。

PPD屬于中醫(yī)“郁證”范疇，與腦神關(guān)系密切［10?13］?！巴ㄔ樂ā笔恰巴ǘ金B(yǎng)神、引氣歸元針法”的簡稱，由全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師、全國中醫(yī)藥傳承博士后指導(dǎo)老師、廣東省名中醫(yī)賴新生教授創(chuàng)立，主張經(jīng)絡(luò)之氣陰陽相應(yīng)、臟腑腹背氣相交貫，疏通經(jīng)絡(luò)必須調(diào)氣，而調(diào)氣關(guān)鍵在于引氣歸元，陰病取陽之背俞，陽病取陰之腹募，二者兼而取之，則陰陽二氣貫通歸元，實現(xiàn)陰平陽秘［14］。研究［15］表明，通元針法治療抑郁性神經(jīng)癥效果顯著。神闕隔藥鹽灸可同時發(fā)揮臍療、藥療的雙重作用，能溫陽補氣，培腎固本，腎中真陽得旺，火能生土，使脾陽充盛，正氣充足，抗御外邪。婦人產(chǎn)后多虛多淤，神闕隔藥鹽灸補益脾腎、芳香行氣、活血通絡(luò)，補而不滯，使血暢氣調(diào)，則產(chǎn)后諸癥得除。本研究為動物實驗，在闡述該療法對于人體的作用及機制方面仍有一定的局限性，未來我們將開展大規(guī)模多中心隨機對照試驗來進一步證實本研究的相關(guān)結(jié)論。

綜上所述，鹽酸氟西汀、常規(guī)針刺和通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕均對PPD大鼠的抑郁癥狀行為、血清CRH、ACTH、Cor水平有顯著的調(diào)節(jié)作用，后者的作用更加顯著。通元針法聯(lián)合隔藥鹽灸神闕治療PPD可能與調(diào)節(jié)HPA軸相關(guān)激素水平相關(guān)。

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