高壓氧預(yù)處理在大鼠同系異體腎移植中的保護(hù)作用

陳曉翔 張輝 楊璐 熊瑋 黃雄慶

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科（廣州 510080）

對(duì)于終末期腎病，接受腎臟替代治療是不可避免的。相較于其他腎臟替代治療，腎移植（kid?ney transplantation，KTx）無(wú)疑是最為有效的治療手段。臨床上，腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfu?sion injury，IRI）是KTx中不可避免的病理生理過(guò)程。腎IRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激損傷、線(xiàn)粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡以及炎性反應(yīng)等［1］。其中，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化是導(dǎo)致腎IRI的主要機(jī)制［2］。目前對(duì)于腎IRI尚缺乏有效的治療方式。

高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療是指在高于1個(gè)絕對(duì)大氣壓的條件下，吸入高濃度氧或純氧的一種治療方式。目前已被證實(shí)是多種疾病的有效治療方式，包括急性一氧化碳中毒、減壓病、突發(fā)性耳聾、缺血性腦卒中、創(chuàng)傷等［3?4］。同時(shí)高壓氧治療也在一些重要器官和組織（腦、脊髓、心臟）的IRI過(guò)程中被證明具有保護(hù)作用［5?6］。

血紅素加氧酶?1（heme oxygenase?1，HO?1）是血紅素轉(zhuǎn)化過(guò)程的限速酶，在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要的細(xì)胞保護(hù)作用。研究［7］表明，HO?1過(guò)表達(dá)可以減輕腎組織所受的自由基損害。通過(guò)化學(xué)或物理手段誘導(dǎo)HO?1表達(dá)增高可能是一種有效的預(yù)防或治療IRI損傷的方法。

目前，高壓氧腎保護(hù)的研究主要集中在腎損傷發(fā)生后［8-9］，而運(yùn)用高壓氧預(yù)處理預(yù)防潛在的腎損害在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。由此，本文擬通過(guò)對(duì)受體進(jìn)行高壓氧預(yù)處理，探究高壓氧是否能減輕移植后腎IRI損傷，并探討其與HO?1間的關(guān)系，為臨床運(yùn)用高壓氧改善移植后腎損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只（購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司），6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為3組：（1）對(duì)照組8只（Sham組）；（2）腎移植組8對(duì)（KTx組）；（3）高壓氧預(yù)處理組8對(duì)（HBO+KTx組）。

實(shí)驗(yàn)主要材料如下：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用高壓氧艙（山東煙臺(tái)冰輪高壓氧艙有限公司）；臺(tái)式動(dòng)物手術(shù)顯微鏡（深圳瑞沃德）；全自動(dòng)生化分析儀（日立7020型）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶）；HO?1一抗（CST，USA）。

1.2 腎移植模型制備 4%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg），待大鼠翻正反射消失后，腹正中切口進(jìn)入腹腔。

供體手術(shù)：運(yùn)用顯微鑷仔細(xì)分離左腎，結(jié)扎腎上腺和生殖靜脈。分離主動(dòng)脈、下腔靜脈及左腎動(dòng)靜脈。在腎動(dòng)脈與主動(dòng)脈連接處上方夾閉主動(dòng)脈，近下腔靜脈處剪斷腎靜脈，用4℃肝素鹽水原位灌注移植腎。待腎臟變白或成花斑狀后，在腎動(dòng)脈上下方剪斷腹主動(dòng)脈，近膀胱處剪斷左輸尿管。取出供腎置于4℃肝素鹽水中保存6 h。

受體手術(shù)：進(jìn)入腹腔后立即切除左腎。仔細(xì)分離腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，分別以無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉移植區(qū)域血管兩端。使用10?0縫線(xiàn)在供體腎靜脈和受體下腔靜脈之間進(jìn)行端側(cè)吻合。同樣在供體主動(dòng)脈與受體主動(dòng)脈之間進(jìn)行端側(cè)吻合。吻合術(shù)成功后，松開(kāi)血管夾恢復(fù)腎灌注，然后通過(guò)輸尿管?膀胱吻合進(jìn)行泌尿道重建。最后切除受體右腎，逐層關(guān)腹。

Sham組開(kāi)腹后切除右腎，不進(jìn)行腎移植；KTx組實(shí)施腎移植手術(shù)；HBO+KTx組在末次高壓氧預(yù)處理24 h后實(shí)施腎移植手術(shù)。

1.3 高壓氧預(yù)處理方案 將大鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)治療5 d，加壓5 min至0.15 MPa（1.5 ATA），同時(shí)純氧洗艙，之后10 min加壓至0.25 MPa（2.5 ATA），穩(wěn)壓吸氧60 min，減壓15 min。艙內(nèi)氧濃度保持在95%以上。末次高壓氧預(yù)處理后24 h，建立腎移植模型。Sham組、KTx組大鼠僅置于高壓氧艙內(nèi)，而不進(jìn)行加壓。

1.4 取材與檢測(cè) 移植24 h后處死大鼠，由腹主動(dòng)脈采血5～6 mL，3 000 r/min離心10 min取上層血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血Scr、BUN。按試劑盒說(shuō)明測(cè)定腎組織中SOD、MDA水平。取左腎腹面下半個(gè)腎組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片后按說(shuō)明書(shū)行HE染色。依據(jù)盲法，將所有組織切片交由同一位病理科人員進(jìn)行Jablonski評(píng)分［10］。腎組織提取總蛋白后按說(shuō)明書(shū)行Western blot檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用one?way ANOVA，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能變化 3組的腎功能指標(biāo)如表1所示，經(jīng)歷腎移植后，血Scr、BUN水平均明顯升高，若經(jīng)高壓氧預(yù)處理，腎損害有所減輕。

表1 各組血清Scr、BUN水平比較Tab.1 Serum creatinine and BUN level of each group x±s

2.2 腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 如圖1所示，高壓氧預(yù)處理能顯著降低移植腎組織MDA水平。HBO+KTx組MDA水平明顯低于KTx組（0.48±0.05vs.0.60±0.11，P＜0.05）。Sham組與HBO+KTx組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.43±0.04vs.0.48±0.05，P＞0.05）。同時(shí)，高壓氧預(yù)處理可顯著提高組織中SOD水平。與KTx組相比，HBO+KTx組中SOD活性明顯升高（152.3±13.75vs.132.0±7.54，P＜0.05）。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色可見(jiàn)，Sham組表現(xiàn)為正常腎組織（圖2A）；KTx組可觀察到腎小管組織壞死、細(xì)胞質(zhì)空泡化等（圖2B）；而在經(jīng)高壓氧預(yù)處理后的組織中，腎小管壞死的比例明顯減少（圖2C）。HBO+KTx組Jablonski評(píng)分明顯低于KTx組。

2.4 腎組織HO?1表達(dá)情況 Western blot結(jié)果提示，高壓氧預(yù)處理后，HBO+KTx組中的HO?1含量明顯高于KTx組。同時(shí)，與Sham組相比，其余兩組中的HO?1含量均明顯升高（圖3）。

圖1 各組移植腎組織中SOD（A）、MDA（B）水平Fig.1 The graft tissue SOD（A）and MDA（B）level of each group

圖2 腎移植24 h后腎組織HE染色（放大倍數(shù)×200）Fig.2 HE staining of graft at 24 h after kidney transplantation

圖3 移植腎組織中HO-1蛋白含量Fig.3 HO?1 level in graft tissues of each group

3 討論

本研究旨在探討高壓氧預(yù)處理在腎移植中的保護(hù)作用。各項(xiàng)結(jié)果表明，對(duì)受體進(jìn)行為期1周的高壓氧預(yù)處理，能夠有效減輕腎移植所致的組織損傷和細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理能夠減輕組織中MDA含量并提高抗氧化酶的活性。與此同時(shí)，高壓氧預(yù)處理還能增加腎組織中HO?1水平，進(jìn)而起到腎保護(hù)作用。

盡管IRI所致腎損傷的機(jī)制目前仍不十分明確，目前認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、過(guò)多的活性氧分子產(chǎn)生以及炎癥因子是主要原因［11］，且活性氧（reactive oxygen species，ROS）在IRI的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［12］。自由基能引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增高、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞激活等。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后腎組織中MDA含量顯著增高（圖1），提示移植后腎損傷與腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。而經(jīng)高壓氧預(yù)處理后，MDA明顯降低。由此可推測(cè)，高壓氧預(yù)處理能夠減輕氧化應(yīng)激所致的脂質(zhì)過(guò)氧化。該作用可能是高壓氧預(yù)處理能誘導(dǎo)SOD等抗氧化酶的活性增高，清除了IRI發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的過(guò)多的ROS，進(jìn)而減輕了脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

1992年，NATH 等［13］首次發(fā)現(xiàn)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）能誘導(dǎo)HO?1表達(dá)，且具有保護(hù)作用。當(dāng)給予大鼠HO抑制劑SnPP以增加腎組織血紅素含量后，腎功能損害嚴(yán)重且腎小管上皮細(xì)胞廣泛受損［7］。近年來(lái)，HULL等［14］也證實(shí)HO?1缺陷小鼠的腎臟更易受到缺血損害。這些研究均表明HO?1在腎IRI具有決定性作用。目前對(duì)于HO?1在氧化應(yīng)激損傷中保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。其中一種解釋是，受損細(xì)胞會(huì)釋放出游離血紅素，并通過(guò)兩種途徑引起細(xì)胞損傷：（1）直接誘導(dǎo)細(xì)胞損傷；（2）產(chǎn)生有害的羥基自由基。而HO?1能夠催化游離血紅素降解，起到細(xì)胞保護(hù)作用。在肺、心、腦等組織的損傷模型中，高壓氧治療已被證實(shí)能夠上調(diào)組織中HO?1的表達(dá)，進(jìn)而起到保護(hù)作用［5］。本研究也發(fā)現(xiàn)，雖然在KTx組中HO?1表達(dá)增多（圖3），但仍無(wú)法應(yīng)對(duì)腎IRI損傷，表現(xiàn)為腎功能受損和腎小管損傷。而在高壓氧預(yù)處理后的HBO+KTx組中，HO?1的含量顯著增多，受到腎IRI的影響更小，腎功能受損及腎小管壞死程度較輕。

綜上所述，在大鼠同系異體KTx模型中，高壓氧預(yù)處理能夠誘導(dǎo)移植腎的缺血耐受，其機(jī)制可能是：高壓氧預(yù)處理能夠減輕移植腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化、增強(qiáng)抗氧化酶活性；同時(shí)上調(diào)組織中HO?1的表達(dá)，提高HO?1含量，從而起到腎保護(hù)作用。

KTx所伴隨的移植腎損傷的原因是多方面的，本研究?jī)H對(duì)腎缺血再灌注這一病理生理過(guò)程進(jìn)行探討。高壓氧預(yù)處理能夠減輕移植腎損傷，但其與HO?1的關(guān)系及相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍有待下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

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