CaMKII 介導(dǎo)20?HETE 誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究

賀滟 賈蟬憶 韓楚依 侯宏保 陳遠(yuǎn)壽 韓勇

1遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室（貴州遵義 563000）；2山西醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室（太原 030001）

20?羥二十烷四烯酸（20?hydroxyeicosatetraeno?ic acid，20?HETE）是由細(xì)胞色素P?450（CYP）酶催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）生成的重要血管活性物質(zhì)［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)20?HETE通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用，參與心肌缺血再灌注損傷（ischemia?reperfusion injury，IRI）進(jìn)程中，加重再灌注后心肌梗死面積的發(fā)生［2］，但其中機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。Ca2+作為重要的第二信使對(duì)于維持心肌細(xì)胞正常功能起到至關(guān)重要的作用，Ca2+平衡紊亂引發(fā)的鈣超載是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素［3-4］。在心肌細(xì)胞中，鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKII）是調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡的重要激酶，其激活后通過影響肌漿網(wǎng)Ryanodine（RyR2）受體通道、肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2a）功能等作用引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，從而參與多種因素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程中［5-6］。然而，目前尚無20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（［Ca2+］i）影響及相關(guān)作用機(jī)制的研究報(bào)道。因此，本研究主要觀察20?HETE對(duì)于培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，并探究這其中CaMKII信號(hào)通路發(fā)揮的作用，為臨床治療相關(guān)缺血性心肌病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 20?HETE、KN?93及Fluo?3/AM鈣離子熒光探針（Sigma公司，美國(guó)），II型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)），DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)），CCK?8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（同仁公司，日本），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物公司，中國(guó)），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司，中國(guó)），小鼠抗SERCA2a（貨號(hào)ab205719）、小鼠抗RyR2（貨號(hào)ab205719）、兔抗CaMKIIδ（貨號(hào)ab205718）及兔抗磷酸化 CaMKIIδ（p?CaMKIIδ，貨號(hào)ab182647）（Abcam公司，美國(guó)），β?actin及HRP標(biāo)記二抗（Proteintech公司，美國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)）。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)采用1～3 d齡SD大鼠，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。乳鼠開胸取出心臟，在冷PBS中將心臟剪成1 mm3碎塊，心肌組織使用0.125%胰蛋白酶和0.01%的Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化10 min，反復(fù)消化6～8次至組織完全消化。將多次消化獲得細(xì)胞懸液1 000g離心10 min，棄上清，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃下5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁培養(yǎng)90 min，將分離純化的心肌細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)液中加入15%胎牛血清，青、鏈霉素（100 U/mL，0.1 mg/mL）及終濃度100 μmol/L的5?溴脫氧尿嘧啶核苷（抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)），于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)48 h后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞無血清培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為4組，A組：對(duì)照組，培養(yǎng)液不做任何藥物處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h；B組：20?HETE組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L的 20?HETE 后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；C 組：20?HETE+KN?93組，培養(yǎng)液中加入KN?93（3 μmol/L）孵育30 min后加入100 nmol/L 20?HETE培養(yǎng)24 h；D組：KN?93組（3 μmol/L），培養(yǎng)液中加入KN?93后培養(yǎng)24 h。

1.4 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞活性 乳鼠心肌細(xì)胞于96孔板中更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，分別加入1、3、10、50和100 nmol/L不同濃度20?HETE，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在不同時(shí)段（0、6、12、18、24 h）檢測(cè)細(xì)胞活性，分別加入10 μL CCK?8溶液孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 乳鼠心肌細(xì)胞使用不同藥物處理后，室溫下使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS溶液沖洗3次，0.1%Triton X?100溶液處理10 min，PBS沖洗后加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37℃下孵育60 mim，熒光顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中核陽(yáng)性熒光占百分比。

1.6 Fluo?3/AM熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞［Ca2+］i乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片上并經(jīng)不同藥物處理后，放入含5%的Pluronic F?127及Fluo?3/AM（5 μmol/L）的DMEM/F12溶液中避光負(fù)載40 min，負(fù)載后使用新鮮DMEM/F12溶液清洗多余染料。激光共聚焦顯微鏡下掃描細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，以平均熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i，ImageJ軟件分析。

1.7 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 乳鼠心肌細(xì)胞于使用不同藥物處理后，加入細(xì)胞裂解液，離心后取上清液BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白（上樣量60 μg）進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，分別加入一抗（小鼠抗SERCA2a、小鼠抗 RyR2、兔抗 CaMKIIδ以及兔抗p?CaMKIIδ）4℃搖床孵育過夜。一抗孵育后加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（抗小鼠或抗兔）室溫孵育1 h。ECL法顯影，暗室曝光，軟件分析蛋白條帶光度值，β?actin作為內(nèi)參，以靶蛋白/β?actin的比值反應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD?t方法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響 結(jié)果如圖1所示，1～3 nmol/L的20?HETE處理6～24 h對(duì)心肌細(xì)胞活性無顯著影響。與對(duì)照組和溶媒組相比，10、50及100 nmol/L的20?HETE處理18～ 24 h后，明顯引起心肌細(xì)胞損傷，其中100 nmol/L的20?HETE處理24 h后，細(xì)胞活性顯著下降至（58.3±4.22）%。結(jié)果表明20?HETE可以時(shí)間及濃度依賴性造成心肌細(xì)胞損傷。

2.2 KN?93對(duì)20?HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響 前期研究發(fā)現(xiàn)20?HETE具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用，本研究檢測(cè)了CaMKII特異性抑制劑KN?93對(duì)20?HETE引起細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖2所示，20?HETE處理后心肌細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯升高，由對(duì)照組的（2.31±1.32）%升至（49.8±2.3）%（P＜ 0.05），而加入KN?93后，細(xì)胞凋亡率恢復(fù)至（23.1±4.2）%（P＜0.05），表明CaMKII信號(hào)通路參與了20?HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

2.3 20?HETE對(duì)［Ca2+］i影響及KN?93的作用 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定對(duì)于維持細(xì)胞正常功能具有重要作用，［Ca2+］i升高引起的鈣超載是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。因此，本研究應(yīng)用Fluo?3/AM熒光探針法檢測(cè)了20?HETE對(duì)［Ca2+］i的影響及KN?93的作用。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，20?HETE組心肌細(xì)胞［Ca2+］i顯著增加了75%（P＜0.05），而加入CaMKII特異性阻斷劑KN?93后，顯著阻斷了20?HETE誘導(dǎo)的［Ca2+］i升高（P＜0.05）。表明20?HETE具有顯著升高［Ca2+］i的作用，誘發(fā)細(xì)胞鈣超載，而CaMKII信號(hào)通路介導(dǎo)了該效應(yīng)。

2.4 20?HETE對(duì)RyR2、SERCA2a蛋白表達(dá)影響及KN?93的作用 蘭尼堿受體通道2（Ryanodine receptor 2，RyR2）和肌漿網(wǎng)鈣泵ATP酶（sarcoplas?mic reticulum Ca2+?ATPase2a，SERCA2a）是心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜上主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和回?cái)z的重要蛋白，同時(shí)也是受CaMKII調(diào)節(jié)的下游靶點(diǎn)。因此，為探究20?HETE誘導(dǎo)［Ca2+］i升高的機(jī)制，我們檢測(cè)了20?HETE對(duì)RyR2和SERCA2a的蛋白水平表達(dá)的影響以及KN?93的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20?HETE處理后的心肌細(xì)胞中，RyR2的蛋白表達(dá)量是對(duì)照組的3.3倍，而SERCA2a的蛋白表達(dá)比對(duì)照組下降32%（P＜0.05）；加入CaMKII特異性阻斷劑KN?93共同處理后，顯著抑制了20?HETE上述效應(yīng)。如上結(jié)果表明，20?HETE通過影響肌漿網(wǎng)鈣通道蛋白表達(dá)改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，同時(shí)CaMKII信號(hào)通路參與了20?HETE這種作用。

圖1 不同濃度和處理時(shí)間條件下20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of 20?HETE on cardiomyocyte activity at different concentrations and treating duration

圖2 KN?93對(duì)20?HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡影響Fig.2 Effects of KN?93 on 20?HETE?induced cardiomyocyte apoptosis

2.5 20?HETE 對(duì)CaMKIIδ表達(dá)及磷酸化的影響 CaMKIIδ亞型特異性表達(dá)于心肌組織，在心肌細(xì)胞的Ca2+調(diào)控中起動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用，CaMKIIδ表達(dá)升高、活性增強(qiáng)被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡、肥大甚至心衰密切相關(guān)。因此，本研究通過Western Blot分析了20?HETE對(duì)CaMKIIδ蛋白和磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，20?HETE顯著增加了CaMKIIδ的表達(dá)并促進(jìn)其磷酸化水平升高（P＜ 0.05），KN?93阻斷了這種效應(yīng)。說明20?HETE可通過激活CaMKII信號(hào)通路機(jī)制誘導(dǎo)心肌細(xì)胞［Ca2+］i升高及凋亡。

3 討論

20?HETE是由CYP酶家族中CYP4A和4F酶催化AA生成的重要血管活性物質(zhì)，大量研究表明20?HETE在調(diào)節(jié)腎、腦、骨骼肌和腸系膜等動(dòng)脈血管平滑肌肌源性收縮中發(fā)揮了重要的作用，它的合成與釋放與多種血管性疾病密切相關(guān)，如高血壓、血管內(nèi)皮功能紊亂、炎性反應(yīng)以及血管再生等［1，7］。近年研究發(fā)現(xiàn)CYP4A和4F酶在心肌組織中表達(dá)，在IRI進(jìn)程中，CYP4A和4F表達(dá)上調(diào)、20?HETE含量增加，WEI等［8］在體大鼠IRI研究發(fā)現(xiàn)，抑制20?HETE合成對(duì)改善大鼠再灌注后心肌具有顯著的保護(hù)作用，可有效減少心肌梗死面積的發(fā)生。然而，20?HETE參與IRI的具體作用機(jī)制尚待研究。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，心肌細(xì)胞凋亡與IRI的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中重要環(huán)節(jié)［9］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE可通過線粒體依賴的內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡［10］。此外，在離體大鼠心肌缺血再灌注模型中研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE可通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重再灌注后心肌損傷［2］。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，CaMKII信號(hào)通路參與20?HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20?HETE呈濃度依賴性導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用；而應(yīng)用CaMKII特異性抑制劑——KN?93，阻斷了20?HETE這種作用，提示CaMKII信號(hào)通路參與了20?HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但其中具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

圖3 20?HETE對(duì)［Ca2+］i影響及KN?93的作用Fig.3 Effects of 20?HETE on［Ca2+］i and the role of KN?93

圖4 20?HETE對(duì)RyR2、SERCA2a蛋白表達(dá)影響及KN?93的作用Fig.4 Effects of 20?HETE on the expression of RyR2 and SERCA2a and the role of KN?93

Ca2+在心肌細(xì)胞的功能與代謝活動(dòng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，它不僅是興奮?收縮耦聯(lián)的重要因子，而且作為第二信使參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控［3-4］，目前已知的細(xì)胞凋亡三條途徑中（線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑）均與細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i升高引起的Ca2+超載密切相關(guān)。因此，為探究20?HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，本研究首先觀察了20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞的［Ca2+］i影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20?HETE可顯著升高心肌細(xì)胞［Ca2+］i，具有誘發(fā)鈣超載作用。在心肌細(xì)胞中，收縮期胞漿中Ca2+主要來源于肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)，RyR2受體通道是釋放鈣庫(kù)Ca2+的主要途徑［11］。在舒張期，胞漿內(nèi)92%Ca2+的清除通過SERCA2a的攝取作用轉(zhuǎn)運(yùn)回肌漿網(wǎng)［3］，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控與RyR2和SER?CA2a的功能密切相關(guān)。因此，本研究觀察了20?HETE對(duì)肌漿網(wǎng)RyR2和SERCA2a表達(dá)的影響，探究20?HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈣超載機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20?HETE一方面可以促進(jìn)RyR2表達(dá)升高，其結(jié)果引起肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)釋放Ca2+能力增強(qiáng)；另一方面20?HETE降低了SERCA2a表達(dá)，導(dǎo)致舒張期肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+回?cái)z能力下降，通過這兩方面機(jī)制導(dǎo)致［Ca2+］i升高，誘發(fā)鈣超載。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用KN?93抑制CaMKII作用顯著阻斷了20?HETE誘發(fā)的鈣超載的效應(yīng)。

CaMKII是機(jī)體內(nèi)重要的蛋白激酶，包括四種亞型，CaMKIIα和CaMKIIβ主要表達(dá)于神經(jīng)組織，CaMKIIγ和CaMKIIδ在多種組織中存在，在心臟中主要表達(dá) CaMKIIδ［6］。近年研究表明，CaMKII在心肌肥大、細(xì)胞凋亡甚至心衰發(fā)病進(jìn)程發(fā)揮關(guān)鍵作用［12-14］。在心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，CaMKII的蛋白表達(dá)增高、磷酸化水平增強(qiáng)［13］，而活化的CaM?KII可通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，其中肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)yR2和SERCA2a是其重要的下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)［3］。CaMKII激活后，一方面通過磷酸化RyR2，增加后者對(duì)Ca2+的敏感性，增加肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)Ca2+釋放；另一方面通過對(duì)受磷蛋白（phos?pholamban，PLB）磷酸化，解除其對(duì)SERCA2a抑制作用，增強(qiáng)肌漿網(wǎng)對(duì) Ca2+的回?cái)z［5，15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，20?HETE顯著上調(diào)CaMKIIδ蛋白表達(dá)，同時(shí)提高其Thr287位點(diǎn)磷酸化水平，表明20?HETE具有明顯激活CaMKII的作用，20-HETE通過對(duì)CaMKII的激活繼而影響RyR2和SERCA2a功能的改變，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的調(diào)節(jié)紊亂，誘發(fā)鈣超載。雖然CaMKII激活后，其直接作用是磷酸化PLB、增強(qiáng)SERCA2a功能，促進(jìn)Ca2+回?cái)z至肌漿網(wǎng)內(nèi)，但有研究表明，SERCA2a回?cái)zCa2+功能還依賴于SERCA2a表達(dá)與磷酸化PLB的比率［16］。本研究中發(fā)現(xiàn)20?HETE可降低SERCA2a總蛋白的表達(dá)，因此通過減小SERCA2a與PLB的比率，從而降低了SERCA2a回?cái)zCa2+能力。如上結(jié)果表明，20?HETE一方面通過直接影響RyR2和SERCA2a的蛋白表達(dá)；另一方面通過激活CaMKII間接影響RyR2和SERCA2a功能，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的紊亂。

近年研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)多種活性物質(zhì)，如異丙腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、腎上腺素、內(nèi)皮素等具有激活CaMKII作用，從而參與相關(guān)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［6，12，17-18］，而本研究中發(fā)現(xiàn)，20?HETE 可上調(diào)CaMKII蛋白表達(dá)、磷酸化水平增強(qiáng)，表明20?HETE具有顯著激活CaMKII效應(yīng)，并通過CaMKII介導(dǎo)了其導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡作用。雖然20?HETE激活CaMKII的具體機(jī)制尚待探明，但我們前期研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE具有激活心肌細(xì)胞L?型鈣離子通道、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及誘發(fā)細(xì)胞內(nèi) ROS 生成等生物作用［2，19］，細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高是激活CaMKII的必要條件，而細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高則可對(duì)CaMKII調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域氧化修飾，阻止與催化結(jié)構(gòu)域的重新結(jié)合從而保持激酶活性［6］。因此，20?HETE 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度及ROS生成的影響是其激活CaMKII的重要的潛在機(jī)制。

綜上所述，以往的研究發(fā)現(xiàn)20?HETE通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡參與IRI進(jìn)程中，本研究在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，20?HETE通過激活CaM?KII，引起肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)yR2和SERCA2a功能改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，這可能是20?HETE加重IRI損傷的重要機(jī)制之一。如上發(fā)現(xiàn)為臨床治療相關(guān)的缺血性心肌病以及心衰的藥物治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)與新思路。

圖5 20?HETE對(duì)CaMKIIδ表達(dá)及磷酸化的影響Fig.5 Effects of 20?HETE on CaMKIIδ protein expression and phosphorylation

參考文獻(xiàn)

［1］WALDMAN M，PETERSON S J，ARAD M，et al.The role of 20?HETE in cardiovascular diseases and its risk factors［J］.Prostaglandins&other lipid mediators，2016，125：108?117.

［2］HAN Y，ZHAO H，TANG H，et al.20?Hydroxyeicosatetraeno?ic acid mediates isolated heart ischemia/reperfusion injury by in?creasing NADPH oxidase?derived reactive oxygen species pro?duction［J］.Circ J，2013，77（7）：1807?1816.

［3］REDDISH F N，MILLER C L，GORKHALI R，et al.Calcium dynamics mediated by the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum and related diseases［J］.Int J Mol Sci，2017，18（5）.pii:E1024.

［4］BOUSETTE N，ABBASI C，CHIS R，et al.Calnexin silencing in mouse neonatal cardiomyocytes induces Ca2+cycling de?fects，ER stress，and apoptosis［J］.J Cell Physiol，2014，229（3）：374?383.

［5］GRIMM M，LING H，WILLEFORD A，et al.CaMKIIdelta me?diates beta?adrenergic effects on RyR2 phosphorylation and SR Ca（2+）leak and the pathophysiological response to chronic be?ta?adrenergic stimulation［J］.J Mol Cell Cardiol，2015，85：282?291.

［6］MOLLOVA M Y，KATUS H A，BACKS J.Regulation of CaM?KII signaling in cardiovascular disease［J］.Front Pharmacol，2015，6：178.

［7］HOOPES S L，GARCIA V，EDIN M L，et al.Vascular actions of 20?HETE［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2015，120：9?16.

［8］WEI Y，XU M，REN Y，et al.The cardioprotection of dihydro?tanshinone I against myocardial ischemia?reperfusion injury via inhibition of arachidonic acid omega?hydroxylase［J］.Can J Physiol Pharmacol，2016，94（12）：1267?1275.

［9］趙文峰，高建芝，張金盈.心肌缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，32（4）：374?377.

［10］BAO Y，WANG X，LI W，et al.20?Hydroxyeicosatetraenoic acid induces apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes through mitochondrial?dependent pathways［J］.J Cardiovasc Pharma?col，2011，57（3）：294?301.

［11］VAN PETEGEM F.Ryanodine receptors：allosteric ion channel giants［J］.J Mol Biol，2015，427（1）：31?53.

［12］CIPOLLETTA E，RUSCIANO M R，MAIONE A S，et al.Tar?geting the CaMKII/ERK interaction in the heart prevents cardiac hypertrophy［J］.PLoS One，2015，10（6）：e0130477.

［13］FENG N，ANDERSON M E.CaMKII is a nodal signal for multi?ple programmed cell death pathways in heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2017，103：102?109.

［14］羅敏，張慧蓉，趙玲.鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ在大鼠胚胎心肌肥大細(xì)胞中調(diào)控血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（12）：1917?1922.

［15］MATTIAZZI A，KRANIAS E G.The role of CaMKII regulation of phospholamban activity in heart disease［J］.Front Pharma?col，2014，5：5.

［16］KEMI O J，WISLOFF U.Mechanisms of exercise?induced im?provements in the contractile apparatus of the mammalian myo?cardium［J］.Acta Physiol（Oxf），2010，199（4）：425?439.

［17］ERICKSON J R，HE B J，GRUMBACH I M，et al.CaMKII in the cardiovascular system：sensing redox states［J］.Physiol Rev，2011，91（3）：889?915.

［18］TAKANARI H，BOURGONJE V J，F(xiàn)ONTES M S，et al.Calmodulin/CaMKII inhibition improves intercellular communi?cation and impulse propagation in the heart and is antiarrhyth?mic under conditions when fibrosis is absent［J］.Cardiovasc Res，2016，111（4）：410?421.

［19］ZENG Q，HAN Y，BAO Y，et al.20?HETE increases NADPH oxidase?derived ROS production and stimulates the L?type Ca2+channel via a PKC?dependent mechanism in cardiomyocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，299（4）：H1109?1117.