中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫中HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑的虛擬篩選*

肖澤云 ，李 凱 ，2，李愛秀 ，3

艾滋?。ˋIDS）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的一種復(fù)雜疾病，其治療一直是醫(yī)學(xué)難題。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，變異性強，在使用單靶點藥物治療AIDS的過程中，病毒容易產(chǎn)生耐藥[1]。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對復(fù)雜疾病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)AIDS等復(fù)雜疾病由多因素共同作用，其病理過程涉及多個細(xì)胞信號分子，僅針對單一細(xì)胞信號分子難以起到良好的治療效果。多靶點藥物能夠多途徑調(diào)節(jié)疾病的信號通路，同時作用于復(fù)雜疾病的多種細(xì)胞信號分子，提高治療效果[2-3]。目前，臨床上采用多藥多靶點藥物即“雞尾酒”療法（HAART）治療AIDS。但多藥聯(lián)用毒副作用更大，容易引起不良反應(yīng)，患者的依從性較差[1]。加之病毒交叉耐藥的產(chǎn)生，影響了HAART的治療效果，新型抗HIV藥物的研發(fā)依然緊迫。與多藥多靶點藥物相比，單藥多靶點藥物為單一化學(xué)實體，藥代動力學(xué)性質(zhì)更好掌握，并且能夠減少交叉耐藥的發(fā)生。目前，雖然尚未有HIV單藥多靶點抑制劑進(jìn)入臨床研究階段，但單藥多靶點藥物已成為抗HIV創(chuàng)新藥物的重要思路。

天然產(chǎn)物數(shù)量巨大，種類繁多，是研發(fā)新藥和尋找先導(dǎo)化合物的重要來源。目前，在針對AIDS的天然產(chǎn)物研究中，發(fā)現(xiàn)了其中不乏對HIV病毒具有抑制作用的化合物。前期，總結(jié)了來源于天然產(chǎn)物的HIV單藥多靶點抑制劑，這些抑制劑按照結(jié)構(gòu)可以分為黃酮類、三萜及其苷類、苯丙素類、蛋白和肽類等，其中數(shù)量較多是黃酮類化合物，包括：蛇葡萄素（Ampelop sin)、燈盞花乙素（S cutellarin）、黃芩素（B aicalein）等[4]。這些抑制劑大多是針對HIV整合酶（IN）、逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和核糖核酸酶 H（RNase H），以作用于IN鏈轉(zhuǎn)移抑制劑 (INSTI)作用位點和RT非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)結(jié)合部位的雙靶點抑制劑[RT（N NRTI）/IN]居多。因此，天然產(chǎn)物對于HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑的開發(fā)具有重要意義。

虛擬篩選[5]是指在計算機(jī)上，運用分子模擬技術(shù)和CADD方法，尋找與受體具有一定親和力的小分子化合物，以提升篩選效率，縮短研發(fā)周期。選擇3-OHHEPT類HIV R T（N NRTI）/IN雙靶點抑制劑[6-7]展開研究，構(gòu)建針對HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑的分子相似性搜索模型，建立NNRTI和RT以及INSTI和IN對接模型[8-10]，并基于兩種篩選策略分別對TCMD[11]進(jìn)行虛擬篩選：策略一，先后利用相似性搜索、利平斯基五規(guī)則和分子對接對TCMD逐步篩選，根據(jù)分子對接的打分高低排序；策略二，前期研究中基于所建的HIV R T（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑六點藥效團(tuán)模型和利平斯基五規(guī)則對TCMD進(jìn)行篩選，得到數(shù)據(jù)庫TCMD-SearchMD[10]，再基于分子對接對TCMD-SearchMD進(jìn)行篩選，根據(jù)打分高低排序。然后，將這兩種策略篩選出的小分子化合物進(jìn)行整理分析，以期從中發(fā)現(xiàn)潛在的HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑。

1 材料

1.1 軟件 分子模擬與分子設(shè)計軟件包MOE2009．10[12]和 SYBYL8．1[13]。

1.2 數(shù)據(jù)庫 TCMD2003．1[11]，包括9 127個化合物結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息；本研究前期對TCMD篩選得到數(shù)據(jù)庫TCMD-SearchMD[10]，包括229個化合物結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息。

1.3 受體結(jié)構(gòu) 從蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB）下載1JLA[14]，為RT與HEPT類NNRTITNK-651的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，實驗室基于IN與5ClTEP復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)1QS4 構(gòu)建的理論模型 1QS4（2Mg2+）[15]。

2 方法

2.1 分子相似性搜索模型的構(gòu)建 本研究分別選擇 TNK-651[16]和已知 3-OH HEPT類 HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑[6-7]中活性較高的化合物1、2（見表1）為模板分子，在MOE相似性搜索模塊分別設(shè)定相似性系數(shù)（Tani moto coefficient）為45%、50%和60%，對TCMD進(jìn)行篩選，比較不同相似性系數(shù)命中的化合物，進(jìn)而確定模板分子和對應(yīng)的相似性系數(shù)。Molecular fingerprinting計算方法設(shè)定為MACCS，F(xiàn)orce field 為 MMFF94x。

2.2 構(gòu)建分子對接模型

2.2.1 配體準(zhǔn)備 分別將配體分子TNK-651和5ClTEP從1JLA和1Q S4（2Mg2+）中抽提出來，在SYBYL配體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備模塊（li gand structure preparatio n）對配體分子進(jìn)行加氫和能量優(yōu)化。參數(shù)Force field選擇 Tripos，Method 為 Powell，Termination 為 Gardient 0．001 kcal/（mol·?），Max Iterations為10 000。

2.2.2 受體準(zhǔn)備 受體準(zhǔn)備在SYBYL Surflex-Dock蛋白結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備模塊(prepare protein structure)完成，首先將1JLA和1QS4（2Mg2+）配體分子TNK-651和5ClTEP抽提出來，保留A鏈，刪除結(jié)晶水，對氨基酸殘基進(jìn)行加氫。然后，分別以1JLA和1QS4（2Mg2+）中配體的坐標(biāo)為中心生成Protomol即結(jié)合口袋，保存結(jié)果用于后續(xù)研究。

表1 模板化合物的結(jié)構(gòu)及活性數(shù)據(jù)Tab.1 Structureand activity data of templatecompounds

2.2.3 分子對接 為確定RT和NNRTI以及IN和INSTI最佳對接參數(shù)，在SYBYLSurflex-Dock模塊，將配體分子TNK-651和5ClTEP分別對接回RT和IN活性位點。選擇標(biāo)準(zhǔn)模式對接，設(shè)定TNK-651的結(jié)晶構(gòu)象和5ClTEP結(jié)合構(gòu)象為參比分子。調(diào)整對接參數(shù)設(shè)置，使配體分子對接構(gòu)象最大程度重現(xiàn)復(fù)合物結(jié)構(gòu)中配體分子原構(gòu)象。一般以配體分子對接構(gòu)象與復(fù)合物中結(jié)晶構(gòu)象之間的均方根偏差（RMSD）值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng) RMSD≤2．0? 時，對接能夠較好地重現(xiàn)出原配體分子的空間位置及構(gòu)象。

2.3 數(shù)據(jù)庫搜索 TCMD庫中包含9 127個化合物，為加快篩選速度，提高陽性率，制定兩種篩選策略[17]。策略一：（1）運用構(gòu)建的分子相似性搜索模型對TCMD進(jìn)行篩選，設(shè)定化合物2為模板化合物，相似性系數(shù)為50%。（2）利用利平斯基五規(guī)則進(jìn)行類藥性分析。（3）將（2）篩選得到的化合物分別與RT和IN活性口袋對接。策略二：將TCMDSearchMD中化合物分別與RT和IN活性口袋對接，對接采用篩選模式，參數(shù)設(shè)置與上文2．2一致。

3 結(jié)果

3.1 分子相似性搜索模板分子和相似性系數(shù) 在構(gòu)建分子相似性搜索模型的過程中，分別以TNK-651和化合物1、2為模板分子，選擇相似性系數(shù)為60%、50%、45%對TCMD進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示，比較發(fā)現(xiàn)當(dāng)相似性系數(shù)為50%時，命中化合物的數(shù)量適中，用于下一步分子對接篩選。而化合物2活性較高，且對RT和IN抑制活性更為均衡。綜合考慮，本研究選擇以化合物2為模板分子，相似性系數(shù)為50%的分子相似性搜索結(jié)果用于后續(xù)研究。見表2。

表2 模板分子相似性搜索結(jié)果Tab.2 Similarity search results of template compounds

3.2 分子對接模型和參數(shù) 本研究分別構(gòu)建NNRTI和RT活性位點以及INSTI和IN活性位點對接模型，通過調(diào)整對接參數(shù)，使配體和酶達(dá)到最合理的相互作用。結(jié)果顯示，TNK-651與RT對接得分為10.60，對接構(gòu)象與1JLA中結(jié)晶構(gòu)象空間距離的RMSD值為0.977?。5ClTEP與IN對接得分為3.98，對接構(gòu)象與1QS4（2Mg2+）中原構(gòu)象空間距離的RMSD值為1.187?。可以看出，空間距離的RMSD值均在2?以下，提示對接構(gòu)象比較完整地重現(xiàn)了配體分子原構(gòu)象的空間位置，程序適用，參數(shù)設(shè)置合理。對接參數(shù)設(shè)置如下：Maxconformationsper Fragment為 20，Minimum RMSD Between Final Poses 為0.05?，Maximum Number of Poses per Ligand 為 20。

3.3 篩選結(jié)果

3.3.1 基于策略一的篩選結(jié)果 本研究將相似性搜索命中的152個化合物利用利平斯基五規(guī)則篩選，命中100個小分子。100個小分子中51個與IN對接打分大于4，有43個與RT對接打分大于4，與IN和RT對接打分均大于4的有28個。其中，與IN對接打分大于6的有8個，與RT對接打分大于6的有14個，與IN和RT對接打分均在6以上的有7個。見表3。

3.3.2 基于策略二的篩選結(jié)果 將TCMDSearchMD中小分子分別與IN和RT進(jìn)行對接，與IN對接打分在4以上的有158個，與RT對接打分在4以上的有195個，與IN和RT對接打分均大于4的有143個；其中，與IN對接打分在6以上的有47個，與RT對接打分在6以上的有121個，與IN和RT對接打分均大于6的小分子有29個。見表4。

表3 基于策略一篩選命中的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑Tab.3 Thedoubletarget inhibitor of RT(NNRTI)/IN against HIV based on strategy onescreening hit

3.3.3 綜合篩選結(jié)果和理論驗證 綜合篩選結(jié)果，除去1個相同的生物堿類化合物M7351，得到35個潛在 HIV R T（N NRTI）/IN雙靶點抑制劑，與 RT和IN對接得分均大于6，對抑制劑的結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行總結(jié)，包括黃酮類（15個）、生物堿類（8個）、多酚類（3個）、苯丙素類（3個）、苷類（3個）、有機(jī)酸類（2個）和醌類（1個），黃酮類化合物占到了42.86%，包括蛇葡萄素、麝香草素、車前子苷等，而策略一對TCMD篩選命中的7個化合物全部為生物堿類。與RT和IN對接結(jié)合較好的化合物蛇葡萄素結(jié)構(gòu)如圖 1（a）所示，圖 1（b，c）為其與 RT 活性位點相互作用2D、3D示意圖，可以看出除疏水相互作用外，蛇葡萄素糖環(huán)3-OH與Lys101、Lys103之間形成氫鍵相互作用，糖環(huán)1-位苯環(huán)與Tyr188之間形成π-π相互作用。觀察蛇葡萄素與IN活性位點相互作用[見圖 1（d、e）]，可以看出其與 IN 之間除存在疏水相互作用和氫鍵相互作用外，還通過氨基酸殘基Asp64和Asp116共同與雙Mg2+發(fā)生金屬離子螯合作用。

4 討論

不同的篩選方法具有各自的針對性和優(yōu)缺點，每種方法均有可能漏篩。本研究通過兩種策略對TCMD進(jìn)行篩選，每種策略既可以篩選到相同的化合物，也可以篩選到不同的化合物。采用兩種策略，能夠相互補充，避免漏篩。TCMD庫包含9 127個化合物，本研究首先采用相似性搜索和藥效團(tuán)篩選，接著運用利平斯基五規(guī)則分析，得到的小分子分別與RT和IN進(jìn)行對接，最終保留潛在的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑。已有研究表明，利用Surflex-Dock程序進(jìn)行分子對接，打分＞4時配體與受體之間存在較強的相互作用，打分＞6則可以預(yù)測配體對受體的抑制活性達(dá)微摩爾級。為加快新藥發(fā)現(xiàn)的速度和減少不必要的浪費，本研究優(yōu)先選擇與RT和IN對接打分均大于6的化合物進(jìn)行分析，以確定率先展開實驗研究的化合物。從數(shù)量上看，命中的黃酮類化合物占到了42．86%，是開發(fā)潛在HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑的主要來源，與文獻(xiàn)報道天然產(chǎn)物中HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑中黃酮類化合物居多一致。

表4 基于策略二篩選命中的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑Tab.4 Doubletarget inhibitor of RT(NNRTI)/IN against HIV based on strategy two screening hit

本研究的篩選結(jié)果與其他研究者實驗研究也有契合點，如實驗表明杜仲提取物能夠抑制HIVgp41六螺旋結(jié)構(gòu)的形成，是潛在的HIV抑制劑[18]，本研究篩選得到來源于杜仲的酚類化合物Koaburaside，Koaburaside具有潛在的HIV RT和IN抑制活性，可能是杜仲提取物抗HIV的物質(zhì)基礎(chǔ)?？鄥⒅械狞S酮類化合物苦參新醇H（K ushenol H）具有弱抗單純性皰疹病毒HSV-1和HSV-2活性[19]，本研究篩選結(jié)果顯示其與HIV RT和IN對接打分均大于6，預(yù)測對RT和IN抑制活性在微摩爾級。此外，化合物蛇葡萄素能抑制HIV的感染，還能干擾HIV對CD4+細(xì)胞的黏附[20]，本研究對接結(jié)果表明蛇葡萄素與RT和IN結(jié)合較好，并與活性位點之間形成了關(guān)鍵相互作用，表明其可能是通過作用于HIV RT和IN，發(fā)揮抗HIV活性。

圖1 蛇葡萄素結(jié)構(gòu)式(a)；與RT相互作用2D圖(b)；與RT相互作用3D圖(c)；與IN相互作用2D圖(d)；與IN相互作用3D圖(e)Fig.1 Structure of Ampelopsin(a);2D diagram of the interaction of Ampelopsin with RT(b);3D diagram of the interaction of Ampelopsin with RT(c);2D diagram of the interaction of Ampelopsin with IN(d);3D diagram of the interaction of Ampelopsin with IN(e)

綜上，本研究運用分子模擬技術(shù)和CADD方法構(gòu)建了針對TCMD的虛擬篩選模型和策略，檢出35個潛在的HIV R T（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑，為天然產(chǎn)物來源的HIV雙靶點藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和發(fā)展方向。

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