健脾利濕湯治療輕中度潰瘍性結(jié)腸炎的療效及其對調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能影響的機制研究*

郝莉莉，劉小溪

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種臨床較為常見的慢性非特異性炎性腸病，常反復(fù)發(fā)作、遷延不愈。病變部位主要在乙狀結(jié)腸、直腸的黏膜和黏膜下層，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、膿血便等。UC病因不明，其發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境、感染等多種因素有關(guān)，但目前公認(rèn)免疫因素在UC的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了至關(guān)重要的角色[1]。

調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）屬于CD4+T細(xì)胞亞群，能抑制炎癥反應(yīng)，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[2]。Treg與多種自身免疫疾病密切相關(guān)，在UC患者腸道黏膜組織也見Treg細(xì)胞增多[3]。Treg能抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）、自然殺傷細(xì)胞（NK）、CD8+T等免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用，而穿孔素-顆粒酶B途徑是上述免疫細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的途徑之一[4]。免疫細(xì)胞識別靶細(xì)胞后分泌穿孔素和顆粒酶B，穿孔素附著于靶細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞膜；顆粒酶B則經(jīng)損傷的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，降解DNA進(jìn)而介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。但穿孔素和顆粒酶B是否與UC發(fā)病相關(guān)，Treg是否通過調(diào)控穿孔素和顆粒酶B的水平發(fā)揮減輕UC炎癥損傷的作用，目前尚缺乏相關(guān)證據(jù)。

本院采用健脾利濕湯治療大腸濕熱和脾虛濕蘊型輕中度UC，取得良好效果。本研究擬深入探討健脾利濕湯的臨床療效，并從細(xì)胞免疫角度揭示其治療UC的機制，為促進(jìn)中藥療法進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒均為北京康為世紀(jì)有限公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒為德國IBL公司生產(chǎn)。所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀、Bio-Tek酶標(biāo)儀等。

1.2 臨床資料

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考2012年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會（廣州會議）制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》[5]。

疾病嚴(yán)重程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用改良的Truelove和Witts疾病嚴(yán)重程度分型標(biāo)準(zhǔn)[6]。

中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2009年中華中醫(yī)藥學(xué)會脾胃病分會《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識意見》中大腸濕熱證和脾虛濕蘊證的表現(xiàn)[7]。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）年齡18～65歲，性別不限。2）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)。3）病情嚴(yán)重程度為輕中度。4）臨床類型為初發(fā)型或慢性復(fù)發(fā)型。5）自愿接受本治療方案并簽署知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）重度UC患者。2）臨床類型為慢性持續(xù)型和暴發(fā)型的患者。3）克羅恩氏病、阿米巴腸病、細(xì)菌性痢疾、腸結(jié)核等感染性結(jié)腸炎、缺血性腸炎、放射性腸炎的患者。4）合并腸穿孔、腸梗阻大出血等的患者。5）合并心腦肝腎等基礎(chǔ)疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤及精神疾病等的患者。6）妊娠期或哺乳期婦女。

1.2.4 剔除標(biāo)準(zhǔn) 1）依從性差者。2）服用治療以外其他藥物影響療效判斷者。3）突發(fā)其他疾病必須終止治療者。4）中途退出或失訪者。

1.3 患者資料 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的59例患者均來自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科門診和病房，其中男23例，女36例，年齡23～65歲，平均年齡45．17歲。臨床類型屬于初發(fā)型的12例，屬于慢性復(fù)發(fā)型的47例。病情嚴(yán)重程度屬于輕度的25例，屬于中度的34例。

1.4 研究方法 采用隨機序列軟件分為對照組30例，健脾利濕組29例。

對照組口服美沙拉嗪腸溶片，急性期每日4次，每次1 g；維持治療每日3次，每次0．5 g。健脾利濕組口服本院自擬的健脾利濕湯（黃連10 g，苦參15g，敗醬草 30g，白頭翁 15g，土茯苓 30 g，當(dāng)歸 15 g，姜黃 15 g，黨參 20 g，炒白術(shù) 20 g，制附子 10 g，防風(fēng)10 g，厚樸 15 g，車前子 20 g），每日 1 劑，水煎服。兩組患者每晚均行錫類散灌腸。治療均持續(xù)3個月。

在治療前、用藥后30 d和用藥后3個月對患者的主要癥狀評分、療效等進(jìn)行評價；于治療前和用藥后3個月兩時間點采集患者靜脈血；并采集10例年齡、性別匹配的正常體檢外周血，作為正常對照，以評價用藥前后患者外周血相關(guān)指標(biāo)的變化。

1.5 療效評定標(biāo)準(zhǔn) 療效評定標(biāo)準(zhǔn)參照2009年中華中醫(yī)藥學(xué)會脾胃病分會《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識意見》和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》制定[6-7]。

1.5.1 主要癥狀評分 主要癥狀指腹痛、腹瀉、膿血便。腹瀉：正常（0分），無腹瀉；輕度（3分），腹瀉每日＜4次；中度（6分），腹瀉每日 4～6次；重度（9分），腹瀉每日＞6次。膿血便：正常（0分），無膿血便；輕度（3分），少量膿血；中度（6分），膿血便為主；重度（9分），全部膿血便或便新鮮血。腹痛：正常（0分），無腹痛；輕度（3分），腹痛輕微，隱痛，偶發(fā)；中度（6分），腹痛或脹痛，每日發(fā)作數(shù)次；重度（9分），腹部劇痛或絞痛，反復(fù)發(fā)作。

1.5.2 證候療效評價標(biāo)準(zhǔn) 按尼莫地平法計算公式計算[7]，療效指數(shù)=[（治療前積分-治療后積分）÷治療積分]×100%。

1.5.3 生活質(zhì)量評價 采用炎癥性腸病問卷（IBDQ）評價患者治療前后胃腸癥狀、全身癥狀、情感能力和社會能力評分。該量表共有32個條目。每個問題進(jìn)行7級評分，總分32～224分，分?jǐn)?shù)越高，代表生活質(zhì)量越好。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）法測定細(xì)胞因子水平 依照試劑盒說明書，檢測血清中促炎因子IL-1β、抗炎因子TGF-β的水平。

1.7 RT-qPCR法測定血中Foxp3、穿孔素和顆粒酶BmRNA的水平 取正常人及患者新鮮血液1．5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，柱提法提取總RNA，取2μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、上下游引物、熒光染料等加入反應(yīng)體系中，RT-qPCR法檢測。引物由蘇州金維智公司合成。Foxp3引物序列為5’-CACTGGTTCACACGCATGTTT-3’和 5’-CACCCGCACAAAGCACTTG-3’；穿孔素引物序列為5'-CGCCTACCTCAGGCTTATCTC-3'和5'-CCTCGACAGTCAGGCAGTC-3'；顆粒酶B引物序列為5'-TGGGGGACCCAGAGATTAAAA-3'和5'-TTTCGTCCATAGGAGACAATGC-3'；GAPDH 引物序列為 5′-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′和 5′-CCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3′。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性15 min；94℃15 s、60℃（Foxp3）/58℃（穿孔素）/59℃（顆粒酶 B）/58℃（GAPDH），均為 30 s；72℃ 30 s；進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，2-ΔΔCT法分析結(jié)果，計算目的基因相對于管家基因GAPDH的表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計方法 使用SPSS 17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；其中主要癥狀評分采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的雙因素方差分析；組內(nèi)和組間兩兩比較采用單變量雙因素方差分析；患者生活質(zhì)量、炎癥因子水平、基因表達(dá)等組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料中無序資料采用χ2檢驗，有序資料采用秩和檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況 正常人10例，其中男4例，女6 例；平均年齡（42．71±3．84）歲。對照組 30 例患者中，男 9 例，女 21 例；平均年齡（44．38±6．53）歲；病情程度，輕度13例，中度17例。健脾利濕組29例患者中，男 14例，女 15例；平均年齡（45．96±6．83）歲；病情程度，輕度12例，中度17例。對照組和健脾利濕組患者在性別、年齡、病情嚴(yán)重程度等方面無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性（P＞0．05）。所有患者均完成12周的臨床試驗觀察。

2.2 患者治療前后主要癥狀評分比較 兩組患者治療前腹痛、腹瀉、膿血便等主要癥狀評分無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。治療 30 d 后，兩組患者上述癥狀均較治療前明顯改善（P＜0．05），但兩組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。治療 3個月后，兩組患者上述癥狀均較治療前有顯著改善（P＜0．05，P＜0．01）；健脾利濕組的改善效果優(yōu)于對照組（P＜0．05，P＜0．01），見表1。

2.3 患者治療前后療效指數(shù)比較 治療30d和3個月后，健脾利濕組療效優(yōu)于對照組（P＜0．05），見表2。

2.4 患者治療前后生活質(zhì)量比較 治療3個月后，兩組患者在胃腸癥狀、全身癥狀、情感能力和社會能力等方面的生活質(zhì)量均較治療前明顯提高（P＜0．05）；且除社會能力外，健脾利濕組在其他方面的改善情況明顯優(yōu)于對照組（P＜0．05），見表 3。

2.5 患者治療前后細(xì)胞因子的變化 與正常人相比，治療前兩組患者血清中促炎因子IL-1β水平較高，而抗炎因子TGF-β水平較低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)（P＜0．01）；經(jīng)過治療，兩組患者血清中上述細(xì)胞因子水平向相反方向變化，與本組治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05，P＜0．01），且健脾利濕組改變更為明顯（P＜0．01），見表 4。

2.6 患者治療前后Foxp3等基因表達(dá)的變化 與正常人相比，治療前兩組患者外周血中Foxp3 mRNA表達(dá)水平較低，而穿孔素和顆粒酶BmRNA表達(dá)水平較高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；經(jīng)過治療，兩組患者外周血中上述基因表達(dá)水平向相反方向變化，與本組治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05，P＜0．01），且健脾利濕組的改變更為明顯（P＜0．05），見表 5。

表1 患者治療前后主要癥狀評分比較（x±s）Tab.1 Comparison the major symptoms scores of patients before and after treatmen（tx±s） 分

表2 兩組療效的比較Tab.2 Comparison of the curative effect of two groups 例

表3 患者治療前后生活質(zhì)量比較（x±s）Tab.3 Comparison of the quality of life of patientsbefore and after treatment（x±s） 分

表4 患者治療前后炎癥因子水平比較（x±s）Tab.4 Comparison the inflammatory factors levelsof patients in the two groups beforeand after treatment（x±s）pg/mL

表5 患者治療前后Foxp3、穿孔素和顆粒酶B mRNA的變化（x±s）Tab.5 Foxp3,perforin and granzyme B mRNA levels in theblood of patients before and post treatment（x±s）

3 討論

近年來，UC發(fā)病率呈逐年增高態(tài)勢。其病程遷延反復(fù)，易致癌變，因而被WHO列為難治性疾病。UC病因不明，但由于UC患者常伴有外周關(guān)節(jié)炎、前葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑等自身免疫性疾??；加之免疫抑制劑對UC具有較好的治療效果，因此免疫因素被認(rèn)為在UC的發(fā)生發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用[1]。

Treg是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞群，通過控制免疫應(yīng)答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)oxp3是其特征標(biāo)志物[2]。研究顯示，與正常值相比，UC患者外周血中Treg數(shù)量降低，而腸道黏膜中Treg數(shù)量增加；UC患者外周血中Treg數(shù)量與疾病活動性呈負(fù)相關(guān)，UC活動期時外周和腸道黏膜的Treg數(shù)量呈一低一高的反方向變化趨勢[1]。循環(huán)中Treg數(shù)量下降可能是UC發(fā)生后的一種適應(yīng)性反應(yīng)，機體藉此募集更多的Treg以減輕腸道組織的炎癥反應(yīng)。此外，UC患者腸道黏膜組織中IL-1β、IL-6等促炎因子水平升高，IL-10、TGF-β等抗炎因子水平下降；隨病情緩解，可見 IL-1β、IL-6 水平下降，IL-10、TGF-β 水平上升[8]。Treg通過分泌TGF-β來抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性；TGF-β又可促進(jìn)T細(xì)胞向Treg分化，由此增加腸道組織中Treg數(shù)量，減輕UC過強的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

穿孔素和顆粒酶B是由CTL、NK、CD8+T等免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞毒性蛋白，兩者與細(xì)胞免疫功能直接相關(guān)，在清除細(xì)菌和病毒感染及對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視方面具有重要作用。研究顯示，活化后的Treg細(xì)胞可表達(dá)顆粒酶B，通過穿孔素/顆粒酶B途徑殺傷多種自體靶細(xì)胞[1]。但目前穿孔素/顆粒酶B途徑與UC發(fā)病之間的證據(jù)還很少。

西醫(yī)治療UC多采用氨基水楊酸類藥物（如美沙拉嗪）、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑（如硫唑嘌呤等）、生物制劑[如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等]。氨基水楊酸類藥物治療UC有效率高，但易引起惡心、嘔吐、白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)。糖皮質(zhì)激素是治療急性期UC最為有效的藥物，抗炎作用強，但不能久用。免疫抑制劑對重度、頑固性UC患者有明顯的治療作用，但其在抑制腸道免疫的同時，也會抑制全身免疫功能，常見不良反應(yīng)主要有肝腎功能異常、白細(xì)胞減少、變態(tài)反應(yīng)、感染等。生物制劑也用于重癥患者，起效快、療效好，但此類藥物價格昂貴，長期應(yīng)用的不良反應(yīng)尚待觀察[9]。相比于西藥，中醫(yī)藥在治療UC、提供機體免疫功能方面有獨特優(yōu)勢。

UC在中醫(yī)學(xué)中，屬于“泄瀉”、“腸澼”等病范疇。主要是由于脾胃虛弱，運化失權(quán)，致使氣血生化不足，從而外邪內(nèi)侵，損傷腸絡(luò)。此外，脾失健運，胃失和降，導(dǎo)致水反為濕，谷反為滯，聚而為患，從而濕熱內(nèi)生，熱毒蘊結(jié)于腸，氣滯血凝，化為膿血而發(fā)病?；赨C脾虛失健、濕熱蘊腸的病因病機，本院采用健脾利濕方劑治療輕中度UC，取得良好療效。方中黃連、苦參清熱解毒燥濕；敗醬草、白頭翁、土茯苓清熱解毒，活血化瘀；當(dāng)歸、姜黃養(yǎng)血活血，通絡(luò)止痛；黨參、白術(shù)益氣健脾；制附子散寒除濕；溫腎暖脾；厚樸、防風(fēng)、車前子行氣化濕。諸藥合用，共湊健脾活血清熱利濕之功。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健脾利濕方劑在改善患者腹痛、腹瀉、膿血便癥狀上明顯優(yōu)于美沙拉嗪；也能更好地促進(jìn)患者生活質(zhì)量的改善。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)UC患者外周促炎因子IL-1β水平較高時，穿孔素和顆粒酶B mRNA表達(dá)水平較高；與此同時，抗炎因子TGF-β水平及Foxp3 mRNA水平則較低。經(jīng)治療，患者病情緩解的同時，上述指標(biāo)均向相反方向變化。說明穿孔素/顆粒酶B的水平與機體內(nèi)炎癥反應(yīng)強度存在一致性，穿孔素/顆粒酶B通路參與了UC病理過程的發(fā)生發(fā)展。健脾利濕方劑通過調(diào)節(jié)Treg的數(shù)量和功能，增強其免疫抑制功能，抑制穿孔素/顆粒酶B對靶細(xì)胞的殺傷作用，以此減輕腸道組織的炎癥反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pedros C，Duguet F，Saoudi A，et al．Disrupted regulatory T cell homeostasis in inflammatory bowel diseases[J]．World Journal of Gastroenterology，2016，22(3):974-995．

[2]Josefowicz SZ，Lu LF，Rudensky AY．Regulatory Tcells:mechanisms of differentiation and function[J]．Annual Review of Immunology，2012，30:531-564．

[3]Holmén N，Lundgren A，Lundin S，et al．Functional CD4+CD25high regulatory Tcellsareenriched in thecolonic mucosaof patientswith active ulcerative colitis and increase with disease activity[J]．Inflammatory Bowel Diseases，2006，12(6):447-56．

[4]Cao X，Cai SF，F(xiàn)ehniger TA，et al．Granzyme B and Perforin Are Important for Regulatory T Cell-Mediated Suppression of Tumor Clearance[J]．Immunity，2007，27(4):635．

[5] 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組．炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年，廣州)[J]．中華內(nèi)科雜志，2012，51(10):818-831．

[6] 鄭筱萸．中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2002:129-134．

[7] 張聲生，李乾構(gòu)，沈 洪，等．潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(2009)[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(5):527-532．

[8]Abdallah HI，F(xiàn)reund JN，Reimund JM，et al．Enteropathogenic e．coli sustains iodoacetamide-induced ulcerative colitis-like colitis in rats:modulation of IL-1β，IL-6，TNF-α，COX-2，and apoptosisi[J]．Journalof Biological Regulators&Homeostatic Agents，2012，26(3):515．

[9] 楊澤云．潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制與治療進(jìn)展[J]．臨床合理用藥，2015，30(8):180-181．