基于超高效液相色譜-質(zhì)譜的漢源花椒麻味物質(zhì)構(gòu)成研究

徐珊珊，張璐璐，高海燕，汪厚銀，史波林，鐘葵，趙鐳*

(1.上海大學 生命科學學院，上海 200444；2.中國標準化研究院食品與農(nóng)業(yè)標準化研究所， 北京 102200；3.浙江工商大學 食品與生物工程學院，杭州 310018)

1 概述

花椒是我國特色辛香料，主要產(chǎn)于四川、陜西、云南等省，其中四川漢源花椒以其色澤丹紅、油重粒大、酥麻爽口、芳香濃郁而聞名于世，素有“川味花椒之王”的美稱[1]。辛麻味是花椒主要風味物質(zhì)和花椒重要品質(zhì)的評價指標[2]。由于地域和氣候影響，不同產(chǎn)地花椒麻感特征差異較大，直接影響花椒在市場上的價格和銷售量。酰胺類物質(zhì)是構(gòu)成花椒辛麻味感的主要成分，花椒麻味感覺強度與其酰胺物質(zhì)的總含量、構(gòu)成和結(jié)構(gòu)具有一定相關(guān)性。目前高精度分析花椒中酰胺類物質(zhì)構(gòu)成的研究較少，尤其是漢源花椒作為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)花椒與其他產(chǎn)地花椒相比，其酰胺類物質(zhì)及主要麻味物質(zhì)特征尚不明確[3-5]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)具有檢測快、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)點[6]。本文在課題組前期研究基礎(chǔ)之上，選取9個漢源花椒樣品及麻味感覺強度(麻度)與漢源花椒相近或較高的我國5個花椒主產(chǎn)地樣品，利用UPLC-MS/MS對樣品中酰胺類物質(zhì)及麻味物質(zhì)進行定性定量分析，并結(jié)合聚類分析和主成分分析等將漢源花椒與其他產(chǎn)地花椒進行比較，得出漢源花椒的麻味物質(zhì)構(gòu)成特征。本研究對促進我國名優(yōu)特產(chǎn)四川漢源花椒質(zhì)量評價、產(chǎn)業(yè)發(fā)展和豐富漢源花椒品質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫等方面具有重要參考意義。

2 材料與方法

2.1 儀器與材料

14個花椒供試樣品：由四川川麻人家食品有限公司提供。樣品均于2016年8月份采摘，自然曬干。其中，S1～S9號花椒樣品均來自漢源花椒主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的不同村，每村5戶標準采樣，混勻后按四分法取樣。其余S10～S14號花椒樣品為其他主產(chǎn)區(qū)花椒種植基地定點采購，漢源花椒為南路(正路)花椒，其他產(chǎn)地花椒均為大紅袍，花椒品種被鑒定為ZanthoxylumbungeanumMaxim.。樣品產(chǎn)地信息見表1。

表1 花椒樣品產(chǎn)地及編號Table 1 Places of origin and number of Zanthoxylum bungeanum samples

羥基-β-山椒素標準品：由西南交通大學、中國標準化研究院研制，并經(jīng)中國食品藥品檢定研究院檢驗符合中藥化學對照品的質(zhì)量要求；無水乙醇：分析純，河南榮騰食品添加劑有限公司；甲醇：色譜純，F(xiàn)isher實驗器材(上海)有限公司；實驗室用超純水。

恒溫水浴鍋 品相科儀(上海)有限公司；PL2002型天平 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；Ultimate 3000超高效液相色譜儀、Hypersll Gold色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)、Q Exactive Focus液質(zhì)聯(lián)用儀 賽默飛世爾(中國)有限公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 供試品溶液制備

將花椒除雜去柄、籽、包籽等，進行粉碎，過20目篩網(wǎng)。稱取15 g(精確到0.01 g)花椒粉，加無水乙醇75 mL，30 ℃條件下超聲提取20 min，超聲后，溶液全部倒入100 mL容量瓶中，無水乙醇定容至100 mL，搖勻后靜置10 min，取上清液0.05 mL用甲醇稀釋定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。每個樣品3個平行樣。

2.2.2 UPLC-MS色譜條件

色譜柱為Hypersll Gold(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動相為甲醇(B)-水(A)，洗脫梯度見表2，檢測波長為268 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.25 mL/min，分析時間為20 min，進樣量為2 μL。每個樣品測定3次，取平均值。

離子源：加熱電噴霧電離源(HESI)，測定模式：Full MS和dd-MS2模式，正離子掃描；Full MS掃描范圍：50～600，噴霧電壓：3500 V；氣化溫度：320 ℃；鞘氣(氮氣)壓力：40 psi；輔助氣(氬氣)壓力：10 bar；毛細管溫度：320 ℃。

2.2.3 花椒酰胺類物質(zhì)的定性分析[7-13]

采用UPLC-MS法對樣品中色譜峰進行定性分析。通過對樣品總離子流圖、提取離子流圖及分子量在50～600之間的離子二級碎片信息進行分析，確定其化合物分子量，計算化合物組成等，并結(jié)合文獻進一步推斷，對色譜峰進行定性。

2.2.4 花椒酰胺類物質(zhì)的定量分析

根據(jù)參考文獻[14，15]中報道的半定量方法以羥基-β-山椒素標準品對花椒酰胺類物質(zhì)進行半定量分析。

標準曲線的繪制：準確稱量一系列羥基-β-山椒素標準品，采用甲醇配制成一系列質(zhì)量濃度的溶液。以高效液相色譜峰面積為縱坐標，對應標品濃度為橫坐標，得到標準曲線方程。為保證定量結(jié)果的可靠性，分別建立兩條低、高含量的羥基-β-山椒素標準曲線，低含量標準曲線為：y=61764x+185.66，相關(guān)系數(shù)R2=0.9988，適用濃度范圍為0.02～0.50 μg/mL；高含量標準曲線為：y=56668x+86333，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，適用濃度范圍為5～200 μg/mL。

2.2.5 聚類分析[16,17]

為探究花椒樣品中酰胺類物質(zhì)種類的構(gòu)成及含量之間的差異性，以樣品中色譜峰面積為變量作為分類依據(jù)。將表1中14個產(chǎn)地中花椒酰胺類物質(zhì)的峰面積數(shù)據(jù)導入SPSS 22.0，利用組間連接法，對14個產(chǎn)地花椒進行系統(tǒng)聚類分析。

2.2.6 主成分分析(PCA)[18,19]

PCA是將所提取的多指標信息通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類，在坐標軸上通過投影將所有信息可視化的一種方法，最終將得到二維的PCA散點圖，通過散點圖可以直觀地看出被分析數(shù)據(jù)之間的相互關(guān)系。PC1和PC2是散點圖中的2個坐標軸，包含了在PCA轉(zhuǎn)換中得到的第1主成分和第2主成分的貢獻率，貢獻率越大，說明主要成分越具有代表性。一般總貢獻率超過70%～85%，此方法即可使用。通過PCA分析方法確定漢源花椒中特征麻味物質(zhì)。

2.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行系統(tǒng)聚類分析，采用Alphasoft 11.0進行主成分分析(PCA)。

3 結(jié)果與分析

3.1 花椒中酰胺類及麻味物質(zhì)的定性分析

表3 花椒樣品中酰胺類物定性和定量分析Table 3 Qualitative and quantitative analysis of amides in Zanthoxylum bungeanum samples

注：“-”代表未檢出。

采用UPLC法得到14個花椒樣品的疊加色譜圖，見圖1，各樣品色譜峰分離度良好。

圖1 14個花椒樣品的UPLC疊加色譜圖Fig.1 The UPLC chromatograms of 14 Zanthoxylum bungeanum samples

利用高分辨質(zhì)譜對花椒中各色譜峰進行定性分析，通過對樣品總離子流圖、提取離子流圖及分子量在50～600之間的離子二級碎片信息進行分析，樣品中各色譜峰由ESI(+)質(zhì)譜圖給出的[M+H]+離子及m/z，可確定離子為加氫離子，即得到化合物分子質(zhì)量，通過高分辨質(zhì)譜二級譜圖信息，計算得出化合物組成、同位素分布等，結(jié)合文獻[20，21]進一步推斷各酰胺類物質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)信息。由表3可知，14個樣品中共得到25種具有酰胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，結(jié)合文獻數(shù)據(jù)分析得出其中包括12種麻味物質(zhì)，分別為花椒油素、羥基-ε-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、α-山椒素、β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-γ-花椒素、花椒素、異花椒素、γ-山椒素、四氫花椒素。25種酰胺類物質(zhì)中，有10種化合物尚未鑒定。漢源9個不同產(chǎn)區(qū)的花椒樣品中共有19種酰胺類物質(zhì)，其中共有峰有18個；差異峰有1個，為二氫花椒素，僅在4個漢源花椒樣品中出現(xiàn)。結(jié)果表明不同產(chǎn)區(qū)漢源花椒的酰胺類主要物質(zhì)組成基本相同。其中，9個漢源花椒樣品均含有除花椒油素、α-山椒素、β-山椒素之外的其他9種麻味物質(zhì)，與趙志峰等在研究漢源干花椒油中麻味物質(zhì)結(jié)果一致。其他產(chǎn)地花椒中，酰胺物質(zhì)種類最多的是陜西韓城花椒，有15種酰胺類物質(zhì)。此外，山東花椒樣品有花椒油素，而其他花椒樣品中均未檢出。

通過與其他5個產(chǎn)地花椒比較發(fā)現(xiàn)，有4個色譜峰只在漢源花椒中出現(xiàn)，其中2個色譜峰為去氫-γ-山椒素和類二氫花椒素，其余化合物名稱及有無麻味等信息目前未見報道，有待進一步結(jié)合酰胺類物質(zhì)分離純化、感官評價及NMR技術(shù)研究進行確定。

3.2 花椒中酰胺類及麻味物質(zhì)的定量分析

通過低含量和高含量所對應的2條標準曲線對14個花椒樣品的酰胺類及麻味物質(zhì)進行定量分析，結(jié)果見表3。由表3可知，漢源花椒9個樣品中酰胺類物質(zhì)總含量在7431.97～10007.65 mg/100 g之間，平均含量為8723.75 mg/100 g，相對標準偏差(CV值)為15.3%；麻味物質(zhì)含量在7216.05～9722.74 mg/100 g之間，平均含量為8473.37 mg/100 g，其CV值為10.5%，表明不同產(chǎn)地的漢源花椒樣品中酰胺類物質(zhì)含量差異較小，具有較高相似度。全國其他5個產(chǎn)地花椒的酰胺類物質(zhì)總含量在922.33～4280.02 mg/100 g之間，麻味物質(zhì)含量在901.60～4189.97 mg/g之間。漢源花椒中平均酰胺類物質(zhì)及麻味物質(zhì)含量均高于其他5個產(chǎn)地花椒樣品，表明漢源花椒作為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)花椒有其獨特質(zhì)量優(yōu)勢。

表3結(jié)果表明：麻味物質(zhì)是花椒酰胺類物質(zhì)的主要構(gòu)成物質(zhì)，占酰胺類物質(zhì)總含量的97%左右。盡管漢源花椒與其他產(chǎn)地花椒在酰胺類物質(zhì)和麻味物質(zhì)的含量、組成上有差異，但14個樣品中麻味物質(zhì)含量占比沒有顯著差異。因此，對花椒樣品中麻味物質(zhì)組成差異進一步展開分析，結(jié)果見表4。

表4 花椒樣品麻味特征物質(zhì)組成分析Table 4 Composition analysis of pungent components in Zanthoxylum bungeanum samples %

注：“-”代表未檢出。

漢源花椒的9種麻味物質(zhì)組成中，5種為山椒素，4種為花椒素，其比例分別為97%和3%，呈現(xiàn)高山椒素、低花椒素的麻味物質(zhì)構(gòu)成特點。山椒素組成中以羥基-山椒素為主，特別是羥基-α-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-β-山椒素，其平均含量分別約占整體麻味物質(zhì)含量的74%，18%和3.5%，4種羥基-山椒素含量約占麻味物質(zhì)含量的96%。9個漢源花椒樣品中各麻味物質(zhì)組成及含量差異不顯著，表明不同地區(qū)的漢源花椒樣品呈現(xiàn)出相似的麻味物質(zhì)構(gòu)成。

其他5個產(chǎn)地花椒樣品中，麻味物質(zhì)構(gòu)成特征也整體呈現(xiàn)高山椒素、低花椒素的特點。山東花椒樣品特異性表現(xiàn)明顯，其花椒油素含量較高，占比為21.2%，而其他花椒中未發(fā)現(xiàn)此類物質(zhì)。青?；ń窐悠分袃H含有羥基-山椒素，且羥基-α-山椒素占比(88.8%)顯著高于其他產(chǎn)地樣品。其余3個產(chǎn)地花椒樣品中，羥基-山椒素占比約為98%，顯著高于漢源花椒；而山椒素和花椒素含量均顯著低于漢源花椒。

3.3 聚類分析

圖2 14個產(chǎn)地花椒聚類分析圖Fig.2 Clustering analysis of 14 Zanthoxylum bungeanum samples

系統(tǒng)聚類可以根據(jù)樣品之間的親疏遠近關(guān)系將四川漢源花椒與全國其他產(chǎn)地14個花椒樣品進行聚類。由圖2可知，14個花椒樣品共聚為三類，其中漢源花椒樣品19個色譜峰中有18個共有峰，化學成分基本相同，麻味物質(zhì)含量在7216.05～9722.74 mg/100 g之間，含量較高，聚為一類(1～9號樣品)；河北、陜西、山西和山東花椒麻味物質(zhì)含量在2586.98～4189.97 mg/100 g之間，屬于中等含量，聚為一類(10，12～14號樣品)。青海花椒樣品中酰胺類物質(zhì)種類最少，只有6種，麻味物質(zhì)含量為901.60 mg/100 g，含量較低，其花椒質(zhì)量明顯區(qū)別于其他產(chǎn)地，因此單獨聚為一類(11號樣品)。

3.4 主成分分析(PCA)

主成分分析法(PCA)是一種常用的多元統(tǒng)計方法，利用降維思想，把具有一定相關(guān)性的多個影響因素轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標進行分析，找出樣品間相關(guān)聯(lián)的特征。選取14個樣品中的12種麻味物質(zhì)進行PCA分析，見圖3。

圖3 基于麻味物質(zhì)含量的花椒樣品主成分分析Fig.3 Principal component analysis of Zanthoxylum bungeanumsamples based on the content of pungent components

注：S為樣品編號，F(xiàn)1為花椒油素，F(xiàn)3為羥基-ε-山椒素，F(xiàn)4為羥基-α-山椒素，F(xiàn)5為羥基-β-山椒素，F(xiàn)10為羥基-γ-山椒素，F(xiàn)12為α-山椒素，F(xiàn)13為羥基-γ-花椒素，F(xiàn)14為β-山椒素，F(xiàn)16為花椒素，F(xiàn)17為異花椒素，F(xiàn)21為γ-山椒素，F(xiàn)25為四氫花椒素。

第1主成分PC1的貢獻率為98.46%，第2主成分PC2的貢獻率為0.83%，總貢獻率為99.29%，說明主成分具有代表性。通過PCA分析把14個花椒樣品分為三類，即S1～S9號樣品為一類，S11樣品為一類，其余樣品為一類，同聚類結(jié)果一致。圖3中S表示樣品編號，F(xiàn)表示色譜峰編號，色譜峰距離樣品越近說明其相關(guān)性越高，以S8樣品為漢源產(chǎn)地花椒聚類中心，分析色譜峰與漢源產(chǎn)地樣品之間的關(guān)聯(lián)性。以向量空間距離來看，色譜峰10為羥基-γ-山椒素，距離漢源樣品最近，相關(guān)性較高。

4 討論

羥基-山椒素(α，β，γ，ε)是花椒中的主要麻味成分，進行分析發(fā)現(xiàn)，本研究中的河北、陜西、山西、山東和青?；ń分械牧u基-山椒素的構(gòu)成特征為羥基-α-山椒素>羥基-β-山椒素>羥基-ε-山椒素>羥基-γ-山椒素，而漢源花椒中的羥基-山椒素的構(gòu)成特征為羥基-α-山椒素>羥基-γ-山椒素>羥基-β-山椒素>羥基-ε-山椒素。與其他產(chǎn)地花椒體現(xiàn)不同的是，漢源花椒中羥基-γ-山椒素含量均大于其他5個產(chǎn)地的，是僅次于羥基-α-山椒素的第二大麻味物質(zhì)，可以看出羥基-γ-山椒素是漢源花椒區(qū)別于其他5個產(chǎn)地花椒的主要麻味物質(zhì)，與主成分分析結(jié)果相一致。Chen Huai-xuan等研究了漢源花椒與西南地區(qū)其他產(chǎn)地花椒的差異。漢源花椒中羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的比例為1∶1.5，青川、茂縣、汶川和重慶產(chǎn)地花椒中的比例依次為19.2∶1，4.5∶1，6.9∶1和5.3∶1；漢源花椒中羥基-γ-山椒素的含量顯著高于其他產(chǎn)地花椒，是區(qū)別于其他產(chǎn)地花椒的主要麻味物質(zhì)，與本研究結(jié)果一致。通過與本研究中5個產(chǎn)地花椒及其他文獻比較總結(jié)可得出，花椒的麻味物質(zhì)構(gòu)成特征整體表現(xiàn)為高羥基-山椒素、低花椒素特點，但不同產(chǎn)地和品種花椒的麻味物質(zhì)構(gòu)成模式不同，四川漢源高羥基-γ-山椒素含量是漢源花椒區(qū)別于其他產(chǎn)地花椒的最主要麻味特征。同時，漢源花椒中山椒素和花椒素含量也略高于全國其他產(chǎn)地花椒。

5 結(jié)論

本文利用超高效液相色譜結(jié)合高分辨率質(zhì)譜(UPLC-MS)，主要探究我國四川漢源花椒中麻味物質(zhì)構(gòu)成種類及含量分析。通過高分辨質(zhì)譜分析，確定14個樣品中共有12種麻味物質(zhì)，漢源花椒中有9種，分別為羥基-α-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-花椒素、γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、花椒素、異花椒素、四氫花椒素。通過定量分析發(fā)現(xiàn)，漢源花椒中羥基-α-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-ε-山椒素的平均含量占總酰胺平均含量的比例達到92.23%，得出漢源花椒麻味物質(zhì)構(gòu)成特征表現(xiàn)為高羥基-山椒素、低花椒素特點。與其他5個產(chǎn)地比較發(fā)現(xiàn)，漢源花椒中羥基-山椒素的構(gòu)成特征為羥基-α-山椒素>羥基-γ-山椒素>羥基-β-山椒素>羥基-ε-山椒素，其中羥基-γ-山椒素含量約為14%，均大于其他5個產(chǎn)地，是僅次于羥基-α-山椒素的第二大麻味物質(zhì)，可看出高羥基-γ-山椒素含量是漢源花椒區(qū)別于其他產(chǎn)地花椒的麻味特征。結(jié)合聚類分析及主成分分析發(fā)現(xiàn)，漢源花椒可以和全國其他產(chǎn)區(qū)樣品進行明確區(qū)分。

花椒品質(zhì)主要體現(xiàn)在麻味感覺強度及麻香兩個方面，本文中利用UPLC-MS對漢源地區(qū)花椒進行定性定量分析，對完善我國名優(yōu)特產(chǎn)漢源花椒的質(zhì)量評價，打造特色產(chǎn)品品牌，促進漢源地方經(jīng)濟發(fā)展等方面具有重要參考意義，在后續(xù)研究中將結(jié)合感官評價、GCMS-O等手段進一步探究不同漢源產(chǎn)區(qū)的花椒麻度及麻香分類情況，從麻味物質(zhì)構(gòu)成、麻味感覺強度及麻香等多維度解析漢源花椒的品質(zhì)特征，以進一步豐富漢源花椒品質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫。

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