TiO2納米管陣列負載鹽酸米諾環(huán)素前后抗牙周致病菌性能的研究*

周志迎， 李婷薇， 張 曄， 程耀東， 王 超， 劉湘寧， 賴仁發(fā)

(暨南大學附屬第一醫(yī)院口腔中心， 暨南大學口腔醫(yī)學院， 廣東 廣州 510632)

鈦微種植體的出現(xiàn)解決了臨床上正畸支抗不足的難題[1]。微種植體在結(jié)構(gòu)上與天然牙有本質(zhì)的區(qū)別，與口腔黏膜上皮的附著也不同于天然牙的結(jié)合上皮，因此其生物屏障作用顯得相對薄弱，容易被細菌微生物及其它炎癥因子侵襲而引起炎癥，導致種植體松動、脫落[2]。種植體周圍炎的致病微生物與牙周炎很相似，主要有牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis, Pg)、福塞坦氏菌(Tannerellaforsythia, Tf)、伴放線放線桿菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans, Aa)、中間普氏菌(Prevotellaintermedia, Pi)和齒垢密螺旋體(Treponemadenticola, Td)等，常規(guī)首選鹽酸米諾環(huán)素(minocycline hydrochloride, MN)局部治療[3]。對微種植體表面進行處理，可提高理化性能，其中納米化表面處理是相關(guān)領(lǐng)域研究熱點。本實驗探討二氧化鈦 (titanium di-oxide, TiO2)納米管陣列負載MN前后對Pg、Tf和Aa早期黏附行為的影響，以期尋找預防微種植體周圍炎的新方法。

材 料 和 方 法

1 儀器與設(shè)備

鈦片(99.0%;新隆鈦鎂五金金屬材料有限公司)；MN(Ameresco)；場發(fā)射掃描式電子顯微鏡(ZEISS ULTRA55)；厭氧培養(yǎng)箱(Electrotek)；常溫高速離心機(Effpendorf centrifug)；凈化生物超凈工作臺(AIRTECH Company)；TSA+5%脫纖維羊血瓊脂(Oxoid)。實驗菌株(Pg、Tf和Aa)均由廣東省微生物菌種保存中心提供(編號分別為Aa： ATCC 29523； Pg： ATCC 33277； Tf： ATCC 43037)。

2 實驗方法

2.1陽極氧化法制備大管徑TiO2納米管陣列 根據(jù)Huang等[4]的方法，將20 mm×30 mm×1 mm的鈦片去除表面的油脂等雜質(zhì)，達到光亮程度；用NH4F (11 g/L)和H2O (15%體積比)配制電解液；陽極氧化法制備TiO2納米管陣列；將氧化好的鈦片取出后加純水和乙醇清洗數(shù)遍，在馬弗爐(FR-1236)程序加熱結(jié)晶。

2.2掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察分析 將制備好的TiO2納米管陣列分成5 mm×5 mm×1 mm大小的規(guī)格，隨機選取3個試件粘結(jié)、噴金后，用場發(fā)射掃描式電子顯微鏡(ZEISS ULTRA55)觀察各試件的表面形貌，每個試件隨機選取3個位點進行觀察。技術(shù)參數(shù)：分辨率6 nm，放大倍數(shù)20～200 000，加速電壓 20.00 kV。

2.3MN負載實驗 將制備好的TiO2納米管陣列分成5 mm×5 mm×1 mm大小的規(guī)格，取10 μL 1 g/L的MN滴加并均勻平鋪于表面，使其負載量達到120 μg，置于25 ℃恒溫真空干燥箱內(nèi)烘干1 h。

2.43種常見牙周致病菌的培養(yǎng) 把3種細菌分別接種在2個含TSA+5%脫纖維羊血瓊脂平板上進行復蘇與培養(yǎng)。用 0.1～0.2 mL的培養(yǎng)液溶解Aa凍干粉，置于37 ℃、 5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后傳代備用；用 0.1～0.2 mL的培養(yǎng)液溶解Pg凍干粉，置于37 ℃、厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)72～96 h后傳代備用；用 0.1～0.2 mL的培養(yǎng)液溶解Tf凍干粉，在培養(yǎng)基中補充乙酸鈉、硫酸鈉和琥珀酸鈉，置于37 ℃、 H2-CO2-N2(1∶1∶8) 氣體混合環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后傳代備用。

2.5抗菌性能的檢測 (1) 實驗分組：鈦片根據(jù)不同處理方法分成3組：單純拋光鈦片(pure polishing titanium, Ti)組、TiO2納米管鈦片(TiO2nanotube titanium, TiO2)組和負載鹽酸米諾環(huán)素(120 μg)TiO2納米管鈦片(TiO2nanotube titanium loaded with minocycline hydrochloride, MN TiO2)組；鈦片均為5 mm×5 mm×1 mm大小。(2) 抗菌率檢測：Aa、Pg和Tf分別制成菌懸液，取80 μL菌懸液滴加于各組鈦片上，置于培養(yǎng)環(huán)境中，4 h后用洗脫液小心洗出菌液，定容于100 mL。將取出的菌懸液吹打均勻，取100 μL于含TSA+5%脫纖維羊血瓊脂平板上培養(yǎng)，觀察并計算菌落數(shù)，重復測量3次，取平均值進行相對抗菌率的計算：相對抗菌率(%)=(Ti組菌落數(shù)-各實驗組菌落數(shù))/Ti組菌落數(shù)×100%。(3)抑菌圈實驗：將上述3組鈦片按照每組5個試件置于培養(yǎng)各細菌的瓊脂平板中央及四個角落,見圖1，培養(yǎng)3 d，計算各抑菌圈直徑大小，重復測量3次，取平均值。

Figure 1. Experimental schematic diagram of bacteriostasis.

圖1抑菌圈實驗示意圖

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析(one-way ANOVA)。單獨效應時，以Levene法進行方差齊性檢驗，方差齊性者采用Bonferroni進行兩兩分析比較；方差不齊者，則采用Tamhane’s T2法進行比較。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 掃描電子顯微鏡觀察分析

本實驗通過陽極氧化法在鈦片表面制成具有穩(wěn)定晶型和管型結(jié)構(gòu)的TiO2納米管陣列，SEM下觀察納米管陣列排列整齊，直徑約為80～100 nm，管間無交聯(lián)，管壁平滑，管壁厚約20 nm，見圖2。

2 細菌復蘇與培養(yǎng)

Aa形成圓凸、邊緣不規(guī)則、半透明的菌落； Pg形成球桿狀、不規(guī)則、半透明的菌落； Tf形成斑點狀、不規(guī)則、半透明菌落。

3 抗菌率檢測結(jié)果

TiO2對Aa、Pg和Tf的抗菌活性較差，4 h后的相對抗菌率僅為20%左右，而MN TiO24 h后的相對抗菌率高達77%以上,見表1。

Figure 2. Scanning electron microscopic diagram of TiO2nanotube arrays.

圖2TiO2納米管陣列掃描電子顯微鏡圖

表1 TiO2組和MN TiO2組4 h后的相對抗菌率

CFU: colony-forming unit.

4 抑菌圈實驗結(jié)果

Ti對Aa、Pg和Tf基本沒有抑菌效果；TiO2抑菌性能較差，其抑菌圈直徑較??；MN TiO2具有較好的抑菌性能，其抑菌圈大小與TiO2組相比有明顯差異，且存在統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各實驗組鈦片抑菌圈大小

△P<0.05vsTi group;＊P<0.05vsTiO2group.

討 論

微種植體周圍炎是導致微種植支抗失敗的主要原因之一，預防微種植體周圍炎是提高植入成功率的重要手段[2]。

牙齦上皮細胞可在鈦、羥基磷灰石等材料表面以基板和半橋粒的形式黏附，這種“生物封閉”機制是種植體成功的理論基礎(chǔ)[5]。根據(jù)Gristina等[6]的“表面競爭”理論，口腔內(nèi)的軟硬組織細胞和細菌微生物會競爭性地在種植體表面附著,促進周圍軟組織細胞和微種植體的早期黏附，抑制致病微生物附著，使纖維結(jié)締組織和上皮組織更為緊密地附著于微種植體頸部，形成良好的種植體周圍軟組織生物封閉，是種植體-軟組織界面研究的熱點問題[5]。

生物材料表面不同的理化處理，可以改變材料對細胞生物學行為的影響。TiO2納米管因具有特殊的管狀結(jié)構(gòu)及較大的比表面積被廣泛應用于生物醫(yī)藥裝飾、藥物運輸?shù)阮I(lǐng)域[7]。有研究表明，隨著陽極氧化時電壓的增大，所形成的納米管管徑也相應增大，可減弱納米管對成纖維細胞早期黏附和增殖的抑制作用，其中在20 V 電壓下陽極氧化形成的納米管管徑為100 nm，并且對成纖維細胞早期黏附和增殖的抑制作用最小[8]。本實驗通過陽極氧化法在鈦片表面成功制成TiO2納米管陣列，SEM下觀察納米管陣列排列整齊，直徑約為80～100 nm，管間無交聯(lián)，管壁平滑，管壁厚約20 nm。Aa是公認與牙周炎密切相關(guān)的致病菌[9]，Pg是慢性牙周炎病變區(qū)域的優(yōu)勢菌群，Tf常在重度牙周炎附著喪失處的齦下菌斑中存在[10]。引起種植體周圍炎的致病微生物與牙周炎很相似[3]，若在種植體植入的早期能夠抑制Aa、Pg和Tf等的黏附，則可以形成良好的種植體周圍軟組織生物封閉。本實驗選取了Aa、Pg和Tf作為目標菌群，采用抑菌圈法檢測負載MN前后TiO2納米管的抑菌作用。結(jié)果顯示， Ti并沒有抗菌性能；TiO2有輕微的抑菌效果，4 h后的抗菌率僅20%左右；MN TiO2則具有較強的抗菌性能，4 h后的抗菌率高達77%以上。

MN又稱鹽酸二甲胺四環(huán)素，對兼性厭氧和厭氧菌作用顯著，為牙周炎局部治療的首選藥物[11]。研究表明，50 mg/L濃度二甲胺四環(huán)素對Pg產(chǎn)生的膠原酶活性有50%的抑制作用，100 mg/L濃度二甲胺四環(huán)素對中性粒細胞的膠原酶活性有65%的抑制作用[12]。本實驗選取120 μg劑量的MN，結(jié)果表明其抑菌率較單純的TiO2提高了將近60%，說明MN TiO2成功負載了MN。若將MN TiO2應用于微種植頸部，推測可在一定程度上抑制Aa、Pg和Tf的早期黏附，使周圍軟組織細胞優(yōu)先附著并增殖分化，形成良好的種植體-軟組織生物封閉，可望在一定程度上提高微種植體的成功率。

[參 考 文 獻]

[1] Piattelli A, Piattelli M, Mangano C, et al. A histologic evaluation of eight cases of failed dental implants: is bone overheating the most probable cause?[J]. Biomaterials, 1998, 19(7-9):638-690.

[2] 胡 赟, 鄭雷蕾, 唐 甜, 等. 正畸微種植體周圍炎對骨結(jié)合界面影響的研究[J]. 華西口腔醫(yī)學雜志, 2011, 29(1):17-20.

[3] Canullo L, Penarrocha-Oltra D, Covani U, et al. Clinical and microbiological findings in patients with peri-implantitis: a cross-sectional study[J]. Clin Oral Implants Res, 2016, 27(3):376-382.

[4] Huang L, Zhang S, Peng F, et al. Electrodepositon pre-paration of octahedral-Cu2O-loaded TiO2nanotube arrays for visible light-driven photocatalysis[J]. Scr Mater, 2010, 63(2):159-161.

[5] Mankoo T. Contemporary implant concepts in aesthetic dentistry--Part 1: Biologic width[J]. Pract Proced Aesthet Dent, 2003, 15(8):609-616.

[6] Gristina AG. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration[J]. Science, 1987, 237(4822):1588-1595.

[7] Sanchez-Tovar R, Paramasivam I, Lee K, et al. Influence of hydrodynamic conditions on growth and geometry of anodic TiO2nanotubes and their use towards optimized DSSCs[J]. J Mater Chem, 2012, 22(25):12792-12795.

[8] 張程程, 巴亞瑪, 張卓然, 等. 鈦種植體表面不同管徑TiO2納米管涂層與軟組織結(jié)合的體內(nèi)研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2014, 24(2):95-100.

[9] Haase EM, Zmuda JL, Scannapieco FA. Identification and molecular analysis of rough-colony-specific outer membrane proteins ofActinobacillusactinomycetemcomitans[J]. Infect Immun, 1999, 67(6):2901-2908.

[10] Yilmaz O. The chronicles of Porphyromonas gingivalis: the microbium, the human oral epithelium and their interplay[J]. Microbiology, 2008, 154(Pt 10):2897-2903.

[11] Nieman GF, Zerler BR. A role for the anti-inflammatory properties of tetracyclines in the prevention of acute lung injury[J]. Curr Med Chem, 2001, 8(3):317-325.

[12] 常麗云. 固定矯治中牙周潔治對維護牙周健康的作用[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2000, 10(3):165-166.